推荐一篇发表在AngewChem上的AcceptedArticle，通讯作者是来自清华大学的刘磊教授，课题组的主要研究方向是蛋白质的化学合成。

泛素化(ubiquitination)，一种由泛素(ubiquitin, Ub)介导的蛋白质翻译后修饰，调节蛋白质降解和DNA修复等多种细胞生理过程。其中，Ub是由76个氨基酸组成的高度保守的蛋白质,在泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)的作用下，其C端与底物蛋白质的Lys侧链形成异肽键。同时，Ub本身有7个Lys(K6,K11,K27,K29,K33,K48,K63)和1个N端的Met，也可以作为自身的底物，在靶蛋白上形成多聚泛素链。在延长过程中，Ub之间若都是通过同一个位点连接，则称为同型的多聚泛素化，即有8种类型；若通过不同位点连接，称为异型的多聚泛素化，将会有多种结构。另外，Ub也可以被翻译后修饰，如乙酰化和磷酸化。所以，聚泛素链多样的结构和泛素的翻译后修饰构成了泛素密码(ubiquitin code)，决定底物蛋白的功能和命运。在细胞中，泛素结合蛋       白(ubiquitin-binding proteins, UBPs)可以解码泛素密码，进入正确的细胞反应。到目前为止，已证实K48泛素链介导蛋白质的降解，K63泛素链参与细胞信号转导和DNA修复。然而，其他泛素链的作用仍不太清楚。因此，若能识别与不同泛素链相互作用的蛋白质，就可能对其细胞功能的揭示提供重要的线索。

去泛素化酶(deubiquitylases,DUBs)是一类可从底物蛋白上移除泛素或聚泛素链的蛋白酶，主要是通过水解泛素羧基末端的肽键或异肽键完成。DUB不仅是泛素-蛋白酶体系统中泛素信号调节的重要的参与者，也在细胞周期和肿瘤抑制等多种细胞过程中发挥重要作用。但是，DUBs底物特异性的分子基础仍不清楚。因此，为了研究DUBs与其天然底物的特异性和结构，利用化学方法制备不同的泛素偶联物是重要的研究工具。

由于天然的异肽键易被DUBs水解，所以研究者们发展了抗水解(DUBs-resistant)的泛素探针，比如利用叠氮和炔的点击反应形成的基于三唑连接的二泛素(diUb)，或重组表达某个修饰位点突变为Cys的Ub末端引入azidohomoalanine(Aha)，在炔丙基丙烯酸酯(propargylacrylate, PA)的作用下形成三唑连接的多聚泛素链(polyUb)。为了扩展非天然异肽键的结构多样性，本文作者发展了一种异肽键N-乙基化的泛素探针。

2012年Brik组通过全合成发现，异肽键N-甲基化泛素修饰的组蛋白H2B可抗DUBs的水解。因此，为寻求更简便的方法，作者首先制备了双功能分子 1（图1a）。同时，加入重组表达的Ub单元，以Ub^K48C为例，1选择性地与Cys反应得到理想的Cys-氨基乙基化的产物 2，再脱去保护基Acm得到 3（图1b），产率为30mg/L。

图1：a：通过两步合成双功能分子1，总产率为20%。b:含有巯基乙基的Ub单元的合成。

接着，为防止Ub变体的分子内偶联，作者将1与Ub^K48C-Asp反应得到3’。N端带有AVI-tag的Ub 4，在10mM ATP的作用下，与E1形成Ub-E1-硫酯中间体。其中，AVI-tag是由15个氨基酸组成的短肽，可在生物素连接酶birA的作用下，位点特异性地在其Lys上连接生物素，可用于富集和纯化。随后再利用巯基苯乙酸(MPAA)促进硫酯交换，进行NCL。最后，在自由基起始剂VA044介导的Cys脱硫反应，得到终产物异肽键N-乙基化的K48 diUb 6，总产率为48%（图2c），并经过HPLC、ESI-MS和SDS-PAGE的验证。同样，作者也制备了异肽键N-乙基化的K27 diUb 7，总产率为6.7%。另外，作者测试了该非天然异肽键的抗水解活性。通过SDS-PAGE分析，在一种能特异性水解K48 Ubs的半胱氨酸蛋白酶humanOTUB1的作用下，对照组天然的异肽键K48-diUb快速水解为单体，而6在2h内都能保持稳定。同样，7在特异性水解K27的DUBOTUD2的作用下保持稳定。该结果与Brik组的观察一致，即异肽键N-烷基化的泛素探针有抗DUB的水解活性。

图2c：终产物异肽键N-乙基化的K48 diUb 6的合成。

然后，作者利用上述方法合成了生物素标记的异肽键N-乙基化的K29diUb 9和polyUb10（图3a）。通过拉下(pull-down)实验，作者分别分析了明显富集的蛋白质。与基于三唑连接的K29diUb和polyUb相比，9和10能捕获到新的潜在相互作用因子（图3b和3c）。该结果说明了异肽键N-烷基化的泛素探针能选择性捕获与其相互作用的蛋白质。

图3：a：E1催化一锅法合成含有异肽键N-乙基化的同型的多聚泛素链。b,c:通过LC-MS/MS和蛋白质非标记定量技术，K29 diUb和polyUb富集具有潜在相互作用的蛋白质的Volcanoplots。

最后，作者同样也获得了K11/K48-分支型triUb和polyUb，以及将该方法应用到任何含有Cys的底物蛋白上，合成了poly-ubiquitinatedH2A突变体和K11/K48-分支型triUb的细胞周期蛋白cyclinB1突变体。另外，作者也测试了Ub C端水解酶YUH1对N-乙基化的H2A的水解活性。

综上，作者在本文中发展一种新的抗DUB水解的泛素探针，可以和其他的泛素探针互补，共同研究泛素-蛋白质组学。

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https://doi.org/10.1002/anie.202002974