斯坦福Eric T. Kool组于2021年发表于Angew. Chem. Int. Ed.的文章，“DNA tiling enables precise acylation-based labeling and control of mRNA”，通过DNA tiling实现mRNA的精准酰基化标记和控制。

信使RNA（Messenger RNAs，mRNAs）能够翻译为蛋白质，并在非编码RNA和骨架结合蛋白的调控下控制基因的表达。mRNA的调控机制与人类的疾病息息相关，尤其是癌症、自身免疫性和神经退行性疾病等。目前，mRNA可以作为疾病治疗的新靶点。例如，新冠疫苗的开发、蛋白质替换以及细胞重编程等。因此进一步了解mRNA的结构、功能、动力学还有相互作用机制对于基础生物学和疾病治疗的发展尤为重要，亟需开发出一个具有普适性的用于mRNA研究的方法。

研究mRNA自然属性和相互作用主要通过标记和偶联的手段。目前开发的研究方法均具有一定程度的缺陷。（1）基于生物工程的方法：将mRNA融合进蛋白质或其他小分子的识别区域。通常会在mRNA中引入适体或茎环等其它设计的序列，可能会改变其二级结构，影响蛋白质和mRNA的相互作用。（2）基于小分子的共价标记方法：例如在转录的过程中加入修饰的核苷酸，实现mRNA的内部标记。但无法实现特定位点的精准标记。以上的标记方法都无法同时实现：mRNA特定位点的内部标记，并且不受特定碱基序列的限制，也无需改变固有的序列。

本文开发了一种mRNA选择性位点酰基化从而实现标记和控制的方法，即Tiled RNA Acylation at Induced Loops (TRAIL)。该方法主要通过结合互补配对的辅助DNA寡核苷酸链保护非酰基化的位点，并暴露诱导形成一个RNA环作为酰基化的选择性位点。该方法可以酰基化mRNA的任意位点，包括非翻译区（UTR）、polyA尾和开放阅读框区域（ORF）。

Fig.1 Schematic outline of the TRAIL approach for site-localized mRNA acylation, illustrating applications in mRNA labeling and control.

TRAIL法主要通过结合互补配对的DNA实现非酰基化位点的保护以及酰基化环状位点的诱导。“保护”DNA链与mRNA结合，保护非酰基化位点；“诱导”DNA链通过与不连续的mRNA位点结合，“挤出”并暴露环状的酰基化位点。酰化试剂NAI-N3与暴露环的2’-OH反应，再用Dnase I去除辅助DNA并纯化后可获得特定位点酰化的功能化RNA。其上偶联的叠氮基团后续可标记荧光基团或生物素，也可通过施陶丁格反应去除叠氮基团恢复生物活性。

Fig.2 Translation behavior and analysis of site-selectively acylated mRNA via TRAIL.

本文选择996 nt的mRNA（编码GFP荧光蛋白）作为模板mRNA，使用16条30-60 nt的DNA寡核苷酸链结合UTR和ORF区域，1条100-150 nt的DNA寡核苷酸链结合polyA尾。用Dnase I处理后并纯化得到的mRNA（FC mRNA）与未结合DNA的RNA（UT mRNA）翻译得到的GFP蛋白荧光强度几乎相同（Fig.2a）。证明Dnase I可以完全去除mRNA上结合的DNA，且对翻译效果无影响。

然后通过改变“诱导”DNA链的结合位点研究不同位点环的酰基化（Fig.2b）。30-60 nt的“诱导”DNA链会在中间空出3-7个与mRNA互补的核苷酸，形成一个RNA环。RNA环一共设计有七个位点：5U-1, KS, OR1, OR3, OR7, OR11,3U-1。在体外翻译实验中，研究不同位点酰基化对翻译效果的影响。其中，FC mRNA翻译得到的GFP蛋白荧光强度设定为100%阳性对照，发现在ORF区酰基化的mRNA翻译得到的GFP蛋白荧光强度均很低，但FC mRNA与酰化试剂NAI-N3反应形成的FC-N的GFP蛋白荧光强度也下降了30-40%，可能存在低水平的本底酰化。

于是，本文进一步通过RT-qPCR研究不同位点酰基化的影响（Fig.2c、d、e）。结果表明，酰基化确实对mRNA的扩增存在阻碍。并通过PAGE凝胶电泳对含7 nt ORF区环的mRNA的逆转录产物进行表征，结果显表明在7 nt环上有多个位点的酰基化。综上，可以通过辅助DNA寡核苷酸链实现mRNA的选择性诱导环位点上高效酰基化。mRNA的位点酰基化能够抑制翻译的进程，进一步控制基因的表达。

Fig.3 (a) Schematic of mRNA control by precise acylation at different sites of ORF. (b) In vitro translation of ORF-acylated mRNAs and deacylated mRNA restored with 7-fold increases in activity by treating with 3mM TPPMS.

随后通过改变mRNA酰基化的位点，实现mRNA生物活性的控制。暴露的环位点先与NAI-N3发生酰基化反应，酰基化位点抑制翻译过程；后续再加入TPPMS发生逆酰基化反应，恢复暴露环位点的2’-OH，一定程度恢复mRNA的生物活性。本文在mRNA的ORF区域分别测试了1/2/3个环状位点酰基化和逆酰基化后对GFP荧光蛋白表达的影响。逆酰基化后1个环状位点的蛋白表达量恢复到50%-70%；2个环状位点的蛋白表达量恢复到40%-50%；3个环状位点的蛋白表达量恢复到30%-40%。结果表明，多个酰基化位点具有更强的抑制翻译能力，恢复的活性也更低。

Fig.4 (a) Schematic of selective ribosome stalling induced by ORFacylated mRNAs. (b) Western-blot analysis of stalled peptides from each acylated mRNA and untreated mRNA (UT). (c) Ribosome stalling comparison of each acylated mRNA with and without phosphine treatment via western blot.

在建立了选择性位点酰基化的方法后，本文又探究了在mRNA的ORF区域上不同酰基化位点对核糖体阻滞的影响。核糖体的阻滞表现为核糖体在mRNA上特定密码子位点的局部积累，从而调控体内的蛋白质稳态。mRNA选择性位点的酰基化可以作为控制核糖体阻滞的一个通用工具。本文分别探究了mRNA的ORF区域上7个酰基化位点对核糖体阻滞的影响。对翻译形成的多肽进行Western-blot表征，结果表明：ORF区域上游存在酰基化位点的多肽条带不清晰，位于下游的酰基化位点的多肽具有清晰的条带。再加入TPPMS逆酰基化后，阻滞多肽的条带消失。此实验进一步证明了，可以通过控制mRNA选择性位点的酰基化实现基因表达的调控。

Fig.5 (a) Schematic of generating selectively biotinylated mRNA via TRAIL followed by click chemistry. (b) Schematic of the pull-down assay for poly(A)-binding protein (PABP) via biotinylated mRNA in vitro and in cells. (c) Detection of the protein PABP (71 kDa), to test the pulldown capacity of biotinlabeled mRNA in vitro and in cells by Western blot.

mRNA的酰基化位点可以通过偶联生物素鉴定与mRNA相互作用的蛋白质。本文在mRNA的UTR区域设计酰基化位点，并与生物素偶联。通过链霉亲和素（SA）与生物素（biotin）的相互作用成功从细胞中分离与mRNA的polyA尾结合的PABP蛋白，并用Western-blot表征。

Fig.6 (a) Schematics of Cy5-labeled mRNA transfection into cells. (b) Schematics of the Cy5 labeling sites in the mRNA. (c) Images of cells transfected with Cy5-labeled mRNAs at different sites.

除了用于相互作用蛋白的鉴定，选择性位点酰基化mRNA还能与荧光基团偶联，实现mRNA在活细胞中的可视化。本文在GFP蛋白的mRNA上标记Cy5，并转染到活细胞中观察其翻译得到的GFP蛋白的荧光强度。结果显示，在UTR和polyA尾区域酰基化的mRNA翻译活性较强，具有明显大量的GFP荧光蛋白；在ORF区域进行酰基化则会阻碍mRNA的翻译，导致GFP荧光蛋白明显减少。综上，选择性位点的酰基化为不影响mRNA翻译活性的标记提供了新方法。

Fig.7 (a) Schematics of stress granule (SG) RNA association studied by monitoring translation and mRNA visualization in the presence/absence of stress. (b) Immunofluorescence images for evaluating translation level of Cy5-labeled mRNAs in the presence/absence of SGs. (c) Magnified immunofluorescence image for tracking Cy5-labeled mRNA localization in the presence of SGs. (d) Plot profile of the fluorescence intensity along the yellow line in (c), showing three peaks of co-localization of Cy5-mRNA and G3BP1-SGs.

为了进一步利用选择性酰基化的方法追踪mRNA和蛋白的相互作用，本文分别在有无应激颗粒的条件下观察了Cy5标记的mRNA的翻译水平。应激颗粒（Stress granules，SGs）是细胞质中相分离的无膜细胞器，由应激反应形成的mRNA和RNA结合蛋白组成，与人类疾病息息相关。实验结果显示，一旦存在SGs则GFP的表达量均显著降低，且mRNA与SGs共定位。这一现象与之前的报道一致，部分mRNA在组装时会定位在SGs内部并且会抑制翻译。该实验进一步证明选择性酰基化方法可用于mRNA的荧光标记，且不会影响其生物活性以及与其他组分的相互作用。

本文构建了选择性酰基化mRNA的通用方法。该方法费用低、操作方便、不会对mRNA的二级结构、生物活性以及相互作用产生影响，并且具有可逆性和可编程性。在应用方法，可通过酰基化引入的叠氮基团进行点击化学反应实现生物素和荧光基团的便捷标记，从而研究mRNA与其他蛋白的相互作用或者对其进行可视化追踪，在mRNA的动力学、相互作用以及功能的研究上具有广泛应用，日后也有望用于非编码RNA的研究。

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课题组链接：

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文献链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202112106?af=R