Angew. Chem. Int. Ed.:利用高灵敏和可逆标记策略实现对细胞表面岩藻糖糖基化的蛋白组学位点分析

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 李睿媌 
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【引言】
核心岩藻糖基化,即α1,6-岩藻糖与N-聚糖最内层的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基的连接,通过调节许多膜蛋白与肿瘤生长、侵袭、转移和免疫逃避密切相关。目前,凝集素结合法因其价格低廉且易于使用成为核心岩藻糖基化分析的主要方法,但是这些凝集素通常具有弱的结合亲和力或交叉反应性。因此,尽管核心岩藻糖基化的生物学功能已被广泛研究,但由于缺乏有效的分析方法,关于其作用机制的细节仍然未知。细胞表面核心岩藻糖基化糖蛋白和糖基化位点的分布,这是研究不同信号通路中核心岩藻糖基化的生物学功能的先决条件,但目前尚不清楚。
 
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【成果简介】
近期,中国科学院上海药物研究所文留青课题组和周虎课题组合作开发了一种用于核心岩藻糖基化糖蛋白的位点特异性定位的可逆标记策略。利用酶标记策略,利用来自伊丽莎白金氏脑膜炎病毒的突变内切糖苷酶,通过生物素化探针以高灵敏度选择性标记位于细胞表面的岩藻糖基化糖蛋白。更重要的是,经亲和树脂富集后,标记的探针可以被酶降解。珠上无痕切割允许通过MS技术对岩藻糖基化糖蛋白和糖基化位点进行全局定位。该成果以A Sensitive and Reversible Labeling Strategy Enables Global Mapping of the Core-Fucosylated Glycoproteome on Cell Surfaces发表在《Angew. Chem. Int. Ed.》期刊上。 


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【图文解读】
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示意图1. 通过可逆标记策略对位于细胞表面的核心岩藻糖基化糖蛋白进行全局定位。

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1. 使用糖肽(AB)和糖蛋白(CD)进行酶活性测试(ND,未检测到活性)。
 
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2. CHO细胞上岩藻糖基化的酶标记的蛋白质印迹(A)和流式细胞术(B)分析。N=4,平均值±标准差,*P<0.05**P<0.01***P<0.001
 
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 3. 通过荧光显微镜对CHO细胞上岩藻糖基化的成像。比例尺:20 μm
 
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4. (A) 捕获和释放标记抗体的工作流程。(B) 捕获(12)和释放(34)过程的蛋白质印迹分析。1, 生物素化利妥昔单抗。2, 链霉亲和素树脂捕获生物素化的利妥昔单抗。3, 将固体树脂与Endo-F3孵育以释放捕获的蛋白质。4, 固体树脂与PBS孵育(对照组)。
 
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5. 利妥昔单抗核心岩藻糖基化位点的鉴定。 (A) 分析岩芯岩藻糖基化位点的工作流程。 (B) 富集前后靶肽的MALDI-MS分析。红色星号表示目标核心岩藻糖基化肽的峰。(C) 岩藻糖基化核心肽EEQYN*STYRLC-MS/MS光谱(*指岩藻糖化核心位点,N297)。
 
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6. (A) pLogo在这项工作中对与岩藻糖基化核心位点相邻的氨基酸进行了基序比对。(B) MDA-MB-231MCF7中糖基化位点的分布。 (C) 比较在MDA-MB-231MCF7中鉴定的CD171CD166抗原上的岩藻糖基化核心位点。
 
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【总结展望】
作者成功地开发了一种可逆标记策略以用于岩藻糖基化的可视化、定量和富集分析。无痕切割使设计的策略成为绘制岩藻糖基化核心糖基化位点的理想而有力的工具。在两种乳腺癌细胞系中都发现了大量与细胞迁移、细胞粘附和基质组织相关的糖蛋白,支持了先前的发现,即岩藻糖基化通过调节许多重要的生长膜相关蛋白促进肿瘤生长、侵袭和转移。该项工作将加速研究岩藻糖基化在各种生物学和病理过程中的作用。
 
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【文献链接】
10.1002/anie.202206802
https://doi.org/10.1002/anie.202206802 


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【作者介绍】
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文留青
2012年和2015年分别获得微生物学硕士和有机化学硕士学位,2017年毕业于佐治亚州立大学化学系,获得博士学位。之后在佐治亚州立大学从事博士后研究。20199月加入上海药物所,任研究员,课题组长。主要从事糖化学和糖生物学的研究。致力于发展高效而又经济的合成方法合成稀有单糖和复杂寡糖,发展以寡糖为基础的寡糖药物;发展新型的技术手段研究寡糖与疾病的关系,并在此基础上从事基于糖的药物新靶标和新药发现研究。
 
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周虎
中国科学院上海药物研究所研究员/博士生导师/课题组长。研究方向为基于质谱的药物蛋白质组学研究:1)有机小分子和生物大分子相互作用的质谱方法学研究;2)转化蛋白质组学研究;3)药物蛋白质组学研究,以寻找药物小分子的作用靶点及其作用机制。2001年于南开大学获生物学学士学位。2007年于中科院上海生物化学与细胞生物学研究所获生物化学与分子生物学博士学位。2008年至2012年在渥太华大学系统生物学研究所进行博士后研究,期间担任质谱实验室主管。20123月担任中科院上海药物研究所研究员和课题组长。
 
 
编辑:李睿媌
审核:尹鹏
推送:彭佳龙


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