分享一篇由韩国先进科技学院（KAIST）化学系Sungwoo Hong教授和韩国基础科学研究所（IBS）Jaebong Jang博士发表在Angewandte Chemie International Edition上的文章Visible-Light-InducedCysteine-Specific Bioconjugation: Biocompatible Thiol–Ene Click Chemistry。Sungwoo Hong课题组研究主要集中在生物和医学中重要分子的合成以及药物研发，包括药物化学、新颖的有机反应的开发、基于计算机辅助和基于片段的药物设计等。生物大分子的化学修饰已经成为推动化学生物学、分子生物学和药物开发的关键，如蛋白质与小分子复合物的发展为蛋白质研究、药物化学和生物技术提供了强有力的工具。半胱氨酸是选择性地将两个分子连接在一起的关键氨基酸，已经在生物共轭化学、药物化学和高分子化学等领域得到应用。其中，硫醇自由基-烯反应形成C-S键是最有前途的半胱氨酸修饰方法之一，因为自由基插入具有高效性并可得到稳定的加合物，但是该方法需要强氧化的条件，这将导致副反应的发生。可见光诱导的生物偶联具有环境可持续性且反应条件温和的性质吸引了大家的关注，然而光氧化还原催化在生物正交反应中的应用仍然具有一定的障碍，如碱或氧化剂与氨基酸残基的耐受性不相容，以及催化剂和光交联剂在水溶液中的溶解性差等问题限制了其在生物化学中的应用。因此，能够在温和且与水相容的条件下产生自由基，进而引发硫醇-烯反应，将是一种有效的蛋白质修饰策略。最近，Sungwoo Hong课题组基于喹啉酮发色单元开发了一种有机光催化剂Q1（图2b），它能够在温和且无金属的条件下通过可见光诱导实现吡啶的多官能化。所以作者使用各种有机光催化剂（Q1，Eosin Y和Mes-Acr+）研究了N-乙酰基-L-半胱氨酸1和烯烃2之间的硫醇-烯反应，如图2a所示。当Q1用蓝色LED照射时，以86％的收率（图2a）形成了所需的偶联产物3。值得注意的是，该方案不需要外部氧化剂，从而可避免带有氧化敏感残基的肽的副反应。由于亲核性官能团的存在可能会影响光催化剂的效率，因此作者接下来通过添加带有反应性官能团的氨基酸衍生物来研究当前方法的化学选择性，发现添加其他带有亲核性官能团的氨基酸后Q1也能够以高产率特异性地催化半胱氨酸-烯烃反应（图2a）。接下来，作者将Q1的光化学性质用于生物分子的荧光标记，合成了具有末端烯烃的Q1衍生物QENE（图2b），它能够以77％的收率形成所需的QENE-半胱氨酸偶联产物。
由于QENE在水溶液中溶解性较差，所以通过调节Q1上的水溶性基团，发现带有八-乙二醇（PEG-8）的衍生物QPEG（图2b）在含10％ v/v乙腈的磷酸盐缓冲液中具有较好的溶解度，并且能够在室温下通过蓝色LED诱导以71％的产率生成加合物4（图3）。接下来作者进一步对该催化机理进行研究。通过Stern-Volmer荧光猝灭实验、循环伏安法以及吸收光谱分析，推测QPEG的激发三重态可以作为氢原子转移（HAT）试剂激发半胱氨酸的S-H键，从而在反应介质中形成相应的巯基自由基。因此，在蓝光LED照射下通过QPEG的HAT过程产生巯基自由基，通过与QPEG的烯烃反应形成烷基自由基加合物A。A能够从另一个巯基中提取一个氢原子，以获得加成产物4并释放可开始新循环的巯基自由基，或者烷基自由基加合物A通过反向氢原子转移（RHAT）从中间体QPEG-H提取氢，以获得产物并再生基态QPEG完成催化循环，如图3所示。
接下来，作者研究了这种光催化方法与谷胱甘肽（GSH）的反应能力，以研究其在羧酸和胺基存在下的可行性，发现QPEG与GSH能够以73％的收率进行反应，当使用带有天然氨基酸的肽底物研究该方法的适用范围和官能团耐受性时，也能够以至少50％的收率获得加成产物（表2a）。并且该方法与蛋白质二硫键还原剂TCEP兼容，在TCEP存在下可以与含二硫键的分子结合（表2b）。
接下来，作者通过去除QPEG的烯基，并通过研究肽与各种重要的生物小分子（例如亲和标签：生物素，生物正交分子：叠氮化物，ALK抑制剂：克唑替尼以及糖）的结合，评估了其催化巯基与烯反应能力。如表3所示，观察到QCAT能够催化半胱氨酸的巯基与烯反应得到相应的加合物。
最后为了研究该方法对三级结构蛋白的适用性，使用泛素K63C（Ub K63C）和牛血清白蛋白（BSA）评估了QPEG和QCAT在蛋白生物偶联中的可及性（图5）。作者将Ub K63C与QPEG在蓝光下孵育，通过LC-MS对混合物进行分析发现质量相当于Ub K63C-QPEG的偶联产物。胰蛋白酶消化后，通过ESI-MS可清楚地观察到标记的Ub K63C-QPEG（图5a）。BSA仅包含一个暴露在表面的半胱氨酸（Cys34）和17个保守的二硫键，采用类似的方法可以分别用QPEG和生物素标记BSA的Cys34（图5b，c）。
综上所述，该文发现了一种光光敏剂QPEG和光催化剂QCAT，它们能够在生物相容的反应条件下介导可见光诱导的半胱氨酸特异性偶联，为光敏剂或生物分子与肽和蛋白质偶联物的制备提供了新方法。https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202010217
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