给大家分享一篇近期发表在Angew Communications上的文章，文章的题目：Chemoselectiveand Site-Selective Lysine-Directed Lysine Modification Enables Single-SiteLabeling of Native Proteins. 本文的通讯作者是印度科学教育与研究学院的维沙尔·赖（VishalRai）教授。

蛋白质的功能多样性及其对重要生物学过程的影响激励着天然蛋白质精密工程方法的发展。随着蛋白质疗法的迅速发展，对选择性技术的需求也在升级，天然蛋白功能化的化学方法引起了相当大的关注。目前，用于标记低频残基、N-末端a胺以及特定N-末端残基的选择性方法已经有所报道，此外，配体-蛋白质相互作用以及组氨酸和赖氨酸残基的独特性质驱动的标签激发了人们对精密工程的信心

作者在2018年，开发了一种使蛋白质中组氨酸的单位点模块化标记的方法（J. Am. Chem. Soc. 2018, 140,15114 −15123.），连接针定向修饰（LDM）（如图1）。

图1 蛋白质中组氨酸的单位点模块化标记

基于此报道，作者本次又利用LDM法尝试对赖氨酸进行单位点标记（如图2）。首先，官能团FK1与所有可接近的赖氨酸残基快速可逆的进行化学选择性反应，这为LDMk-k法提供了连接针，并调节了近端赖氨酸残基附近Fk2的微量浓度。最后FK2与赖氨酸的分子内不可逆反应决定了其位点选择性，这个工程的相对反应性保持了背景反应的可控性，此外，分子内反应决定的位置选择性可以容忍反应条件中的微扰动。但是要实现这一方法，必须要克服一个问题：附近的任何两个赖氨酸残基都会有相似的微环境，并与FK1以同样的效果反应，同样会造成异质性。作者认为如果Fk1可以优先于赖氨酸对中的一个赖氨酸残基反应，并且FK2可以阻止FK1对其邻近的赖氨酸的反应，那么这种方法就是可行的。

图2 LDM法对赖氨酸进行单位点标记

基于之前的发现，作者选用邻羟基苯甲酸作为FK1，FK2的选择，作者认为应希望其在不可逆反应中为赖氨酸提供高的化学选择性，而且与FK1相比要有相当慢的分子间反应，这是为了消除非选择性背景反应。因此，作者选用酰化基团作为潜在的FK2，因为它对胺具有化学选择性，并产生稳定的C-N键。

接下来，作者选取的了六个活化的含有不同离去基团的羰基化合物2a-2f（如图3），并选用核糖核酸酶A作为模型蛋白，我们可以看到，2d-2f的转化率基本上可以忽略不计，这也就排除了非选择性的分子间背景反应，但是2f比2d、2e的溶解性要好，而且对水解更稳定，因此选定2f的羰基化合物为FK2。 

图3 含有不同离去基团的羰基化合物2a-2f，筛选FK2

之后作者又合成了具有不同间隔物的LDMK-K试剂4a-4f（如图4）。可以看到，4a与模型蛋白核糖核酸酶A结合，在16小时内形成了单标记的核糖核酸酶A6a（如图5），转化率为34%，用O-羟胺对蛋白质偶物进行后期修饰，转化率可以达到99%，这确保了通过连接针与蛋白质结合的LDMK-K试剂的方便移除，并利用MS-MS测序证实了K7的位点选择性修饰，基于此，作者又进一步尝试对其他蛋白进行标记，并发现均能够在较短的时间对多种蛋白质进行单标记，达到36%-48%的转化率，并利用MS-MS测序等方法证实了其修饰的单位点。

图4  LDMK-K试剂设计（4a-4f）

图5  利用LDMK-K实现蛋白质的单位点标记

在确定了LDMK-K蛋白单位点标记的有效性后，作者制定了探针后期安装的方案。FK1与核糖核酸酶A结合后以环亚胺7和游离氨基醛8两种形式共存（如图6），一旦FK1完成了连接针的工作，他就提供了一个化学正交安装不同探针的场所，为了实现这一点，作者合成了三种o-羟胺衍生物，经处理可得到安装NMR、亲和、荧光团标签的10a-10c。

之后作者就利用FK1的多功能性建立了一种高效的固定化和纯化的方法。如图所示，使用LDMk-k试剂4a进行单位点标记后，核糖核酸酶A形成7/8，将产物7/8和未反应的核糖核酸酶A与酰肼活化树脂在蛋白质纯化柱中混合，未反应的核糖核酸酶A被回收，产物通过K7被选择性的固定在树脂上，且效率很高，可达到95%，之后将树脂分布于四个管，将其与O-羟胺及其衍生物进行转肟化。随后树脂被循环利用，离心自旋浓缩产生带有羟胺和三种不同探针的分析纯K7标记的核糖核酸酶A。19-FNMR、生物素和荧光团的并行安装可以以极高的效率实现。

图6 单点标记的蛋白质的固化提纯

精确的抗体偶联的化学方法对于治疗和诊断是必不可少的，作者应用LDMK-K技术在单克隆抗体（mab）上安装荧光团和负载。证实了LDMK-K能够合成ADC，并且对HER-2阳性的SKBR-3乳腺癌细胞表现出高度特异的抗增殖活性。

综上所述，作者开发了一种连接针定向修饰(LDMK-K)用于蛋白质中赖氨酸残基的单位点标记的方法。在这一过程中，LDMK-K试剂有效地调节了化学选择性、位点选择性和模块性。该方法与呈现广泛结构复杂性的多个蛋白质一起工作。此外，FK1通过后期修饰为有序固定以及安装所需标签创造了额外的机会，它使NMR标签、亲和标签和荧光团标签的精确和并行引入成为可能。未反应的天然蛋白的方便回收和酰肼活化树脂的循环使用使纯化方案具有成本效益。此外，LDMK-K能够合成ADC，对HER-2阳性的SKBR-3乳腺癌细胞表现出高度特异的抗增殖活性。