Angew. Chem. Int. Ed.||利用共价核酸适配体进行蛋白标记和交联

大家好，本次给大家分享一篇即将发表在Angewandte ChemieInternational Edition上的文章。文章的题目是“Protein Labeling andCrosslinking by Covalent Aptamers”（DOI：10.1002/anie.202101174）。该文的通讯作者是美国匹兹堡大学化学系的Alexander Deiters教授，他的主要研究领域包括化学生物学、化学遗传学、合成化学、合成生物学和光化学。

目前研究人员对蛋白质进行共价修饰都是通过生物正交反应进行的，这促进了许多生物学研究和基于蛋白质的治疗方法的发展。蛋白质偶联的常见方法包括代谢标记、基于活性的标记、将目标蛋白（POI，the protein of interest）融合到酶或多肽标签和插入非天然氨基酸等。对生物环境中的天然蛋白进行特异性共价修饰一直是一个挑战。一种方法是用亲电性的反应基团（warheads）修饰小分子抑制剂和配体。另外一种可作为互补的方法是化学选择性和位置选择性亲电试剂被用来转移功能标签到目标蛋白。在此，作者选择了适配体作为蛋白质结合的方式。核酸适配体是一种短的、单链的核酸分子，通过强大的选择策略生成，以精细的亲和力和特异性结合靶点它们是多种用途的核酸工具。核酸适配体与其目标蛋白在一个大的表面积上相互作用，因此，单个核苷酸的化学修饰不太可能取消它们的结合亲和力。此外，寡核苷酸是通过自动化学合成产生的，因此很容易获得。

在该文中，作者报道了第一个使用可断裂亲电试剂修饰的核酸适配体的例子，这些核酸适配体可以将化学修饰转移到蛋白质上（图1）。适配体作为目标蛋白质的亲和配体，将其共轭亲电试剂带到亲核残基附近，然后将选择性共价标记转移到蛋白质上。核酸适配体在形成共价交联的同时从亲电试剂中被裂解，与目标蛋白分离。

图1 核酸配体标记转移的机制。

根据已有的研究，作者选择凝血酶以及能够与其结合的核酸适配体TBA（5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’）为例来进行接下来的研究。首先作者合成了带有炔基的TBA以及带有叠氮基和Biotin的可断裂的亲电试剂1和2。1和2中的可断裂的亲电基团分别为苯甲磺酸基（tosyl cleavable electrophile）和N-乙酰磺胺基（N-acylsulfonamide cleavable electrophile）（图2）。作者首先利用western blot评估了在6个不同位置炔基的TBA和两种可断裂亲电试剂结合后与凝血酶的标记情况，结果都显示出了标记效果的位置依赖性，通过动力学实验表明亲电试剂2的标记效率要比1更好，因此作者后面的实验都用2进行。

图2 WB结果以及两种试剂的结构和反应机制

为了确保所安装的亲电试剂不会降低适配体与蛋白的亲合力从而阻碍整体效能，并确保图2B中观察到的位置偏好并非来自于特定位置上的核弹头所引起的空间干扰，作者测定了标记转移效率高和低的3位修饰的TBA(3)和9位修饰的TBA(9)的结合常数。并且通过合成的带有荧光素的标记分子对蛋白标记的荧光实验证明了标记效率的差异不是由于适配体-蛋白质相互作用的干扰(例如，由于空间位阻)，而是由于弹头在蛋白质表面易接近的赖氨酸残基的不同位置。通过质谱测序，在与凝血酶孵育时，TBA(3)-2仅对19个赖氨酸中的5个进行生物素化，进一步证实了这一点。根据TBA与凝血酶的晶体结构显示这些赖氨酸位于适配体-蛋白结合界面上。同时定量结果显示，K149、K109-110和K36的生物素化率分别为91%、74%和4%，显示了标记转移的位点选择性。

紧接着作者利用新合成TBA(3)-2，确定了可以实现的最大蛋白质标记效果。同时作者还研究了共价适配体对目标蛋白选择性，发现凝血酶(300 nM)在过量的BSA (1.5 M)存在下被生物素化，该蛋白有3倍的赖氨酸(60)（图3A）。凝血酶和TBA(3)-2在人血浆中孵育(~1.5 mM总蛋白浓度)，再次观察到高效的目标标记，而在适配体浓度高达500 nM时，没有其他蛋白被生物素化(图3B)。时间过程实验显示凝血酶的共价修饰不仅具有选择性的，而且是快速反应的，t_1/2分别为9.6 min和0.5 M的TBA(3)-2（图4C）。

图3 TBA(3)-2对凝血酶标记的选择性实验

虽然到目前为止所有共价标记反应都导致核酸适配体从目标蛋白质释放，但倒转弹头将导致目标蛋白质和适配体之间的共价交联，而不是转移标签（图4A）。共价的蛋白-寡核苷酸偶联物已经被开发了多种应用，包括蛋白质固定化、试剂发展、和药物传递等。因此，作者又合成了TBA(3)-4来进行实验。并测试了其EC₅₀值、在血浆中的选择性标记实验、生物素化的时间过程实验、位置选择依赖性实验等，都得到非常好的效果。

图4 TBA(3)-4的相关实验数据

总结，作者开发了一种能够快速和选择性蛋白共价标记的适配体。它将生物素和荧光团等功能基团转移到缓冲液和人血浆中的天然凝血酶。标记具有蛋白质特异性和赖氨酸化学选择性。部分位点特异性被观察到，只有赖氨酸在适配体结合界面被修饰。交联亲电性弹头的倒置使蛋白质-寡核苷酸偶联物的快速形成成为可能。共价适配体抑制凝血酶的酶活性比其非共价适配体更有效。作者期望该文提出的方法广泛适用于现有和未来的核酸适配体，并使这类重要的核酸探针在蛋白质修饰、检测和抑制等方面的新应用成为可能。