化学修饰的蛋白质已经广泛应用于细胞追踪、成像、生物材料和药物治疗等领域。虽然基因工程可以将非天然氨基酸整合到重组蛋白质中，但野生型蛋白质的区域选择性化学修饰依然是一个挑战。今日给大家分享一篇2021年发表在Nature Chemistry上的工作，文章标题为 “Site-selective tyrosine bioconjugation via photoredox catalysis for native-to-bioorthogonal protein transformation”，这篇工作通过开发一种光氧化还原催化介导的位点选择性酪氨酸生物偶连途径，可直接在天然蛋白上偶连生物正交甲酰基团，进而实现天然蛋白的多功能修饰，即使在蛋白底物上存在多个酪氨酸位点的情况下，依然实现单一酪氨酸位点的高度选择性修饰。该论文的通讯作者是普林斯顿大学默克催化中心的 David MacMillan教授。

本文作者所开发蛋白修饰策略如图1所示，该方法结合了位点选择性生物偶连与生物正交化学反应实现修饰。生物正交小分子吩恶嗪二醛与天然蛋白上的酪氨酸位点在光氧化还原反应介导下实现偶连，利用醛基基团的生物正交反应性能，可以进一步对蛋白进行丰富的功能化修饰。

图1 天然蛋白质位点选择性修饰策略

作者首先对化学特异性的酪氨酸生物偶连途径进行验证（图2），以小肽药物比伐卢定为模型底物，实验结果证明了在光反应条件下，生物正交化合物吩恶嗪二醛对于比伐卢定实现了95%高转化率，酪氨酸特异性的化学偶连。

图2 酪氨酸特异性生物偶连途径验证

接下来作者评估了多种天然蛋白（5.8-77 kDa）酪氨酸生物偶连的位点选择性（图3）。所有测试的蛋白质均表现出高的位点选择性，溶菌酶，核糖核酸酶，血红肌红蛋白均得到了单一位点修饰的产物，血清转铁蛋白是作者测试的最大的蛋白，包含了26个酪氨酸位点，依然可以以极好的位点选择性反应提供单一产物。

图3 天然蛋白质的酪氨酸生物偶连修饰

作者对酪氨酸修饰的位点选择性成因进行了解读。酪氨酸具有两亲性，在蛋白上存在于多种微环境之中。蛋白上酪氨酸位点所处的局部微环境影响着位点的反应活性，反应性最强的酪氨酸是溶剂高度暴露的，并且与周围水分子或氨基酸形成氢键，增加了酪氨酸芳环上的电子密度（图4）。而失活的酪氨酸位点一般在空间上不可及，或者具有不利的电子因素（cation-π作用削弱酪氨酸芳环上的电子密度）。

图4 酪氨酸微环境

在内源性酪氨酸与各种天然蛋白质实现了位点选择性生物偶连之后，作者接下来测试了偶连上的醛点击手柄的生物正交效用，利用醛与酰肼和烷氧基胺类化合物在生物相容性条件下的缩合反应，成功将各种小分子接头整合到功能蛋白质加合物中，包括荧光花青染料，生物素，叠氮化物和炔基，成功实现了修饰蛋白的进一步功能化（图5）。

图5 酪氨酸偶联产物的功能多样化

此外，作者发现生物正交修饰并不显著影响蛋白的生物活性和蛋白结构，结合光氧化还原催化方法的温和性，这种策略有望实现更多的生物相容的下游应用。酪氨酸-吩恶嗪二醛偶连物具有荧光属性，可用于复杂细胞环境中跟踪偶连产物。

总之，作者通过使用光氧化还原催化实现了内源性和生物正交标记技术的结合，在温和的低温条件与水性缓冲液条件下，将生物正交官能团（吩恶嗪二醛）位点选择性地耦合到各种天然蛋白质上特定酪氨酸残基的酚侧链。进而利用生物正交化学反应引入更为丰富的蛋白功能化修饰。该技术的单点化学选择性特性能够合成均匀功能化的蛋白质加合物。从复杂蛋白质框架上的多达 26 个酪氨酸残基中选择一种酪氨酸的能力说明了生物微环境对氨基酸亚基的固有局部电子学和亲自由基反应性的显着影响。未来可见光介导的光催化反应有望用于更多的天然蛋白质修饰。

【本文作者】

张金月

黄硕课题组博士生