今天为大家分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，题目为“Folding-upon-Repair DNA Nanoswitches for Monitoring the Activity of DNA Repair Enzymes”，本文中作者设计了一种可以检测DNA甲基转移酶活性的DNA纳米开关。本文的通讯作者是来自罗马第二大学的Alessandro Porchetta博士，Francesco Ricci教授和来自意大利国家研究委员会的Giuseppe Perugino博士。

图1 DNA纳米开关原理图与荧光表征

为了进一步解释G碱基O⁶甲基化对三链结构的影响，作者对设计的纳米开关进行了分子动力学的模拟。作者模拟了如图2(a)所示序列的三链DNA纳米开关，并重点关注了2个参数：如图2(b)所示的碱基G₇和C⁺₃₅的展开角和如图2(c)所示的碱基G₇和C⁺₃₅的距离。当纳米开关形成稳定的三链结构时，这两个参数的分布曲线呈单峰且分布很窄（图2(d), (e)左）。而当加入1个和2个O⁶-MeG碱基时，其展开角和距离分布呈现了多个峰，且分布变宽，说明存在多种松散的三链结构，进一步证明了O⁶-MeG碱基可以破坏DNA纳米开关的三链结构。

图2 DNA纳米开关的分子动力学模拟

接下来作者通过SDS-PAGE表征了纳米开关与多种甲基转移酶的反应。甲基转移酶只能参与一次去甲基反应，当甲基转移酶与纳米开关上的O⁶-MeG发生反应后，甲基会转移到酶上的反应位点巯基上，使酶无法再进行甲基转移反应。因此作者在甲基转移酶与纳米开关反应后加入了荧光底物O⁶-BG荧光衍生物，从而通过甲基转移酶上的绿色荧光强度判断它是否与DNA纳米开关上的O⁶-MeG发生反应，并通过纳米开关的FRET信号判断其是否可以形成三链结构。作者首先尝试了人类甲基转移酶（hMGMT）和具有热稳定性的硫磺矿硫化叶菌甲基转移酶（SsOGT）与纳米开关的反应，如图3(c)所示，当不加入纳米开关和加入Triplex开关时，甲基转移酶只与荧光底物发生反应，而加入1-Me Triplex和2-Me Triplex时，甲基转移酶上没有绿色荧光信号，而纳米开关可以形成三链结构，说明甲基转移酶与纳米开关发生了甲基转移反应。作者又将纳米开关与两种对照酶——不和O⁶-BG反应的E. coli Ada-c酶以及只与O⁶-BG反应不与O⁶-MeG反应的突变酶SsOGT-H⁵酶孵育，得到的结果也符合预期，E. coli Ada-c处理后酶上没有绿色荧光信号，而SsOGT-H⁵酶处理后2-Me Triplex纳米开关保持了其电泳条带移动速度快的性质，证明它没有发生去甲基化反应。这些实验证明了此纳米开关的构象可以受到甲基转移酶的调控。

然后作者研究了纳米开关构象变化与其FRET信号的相关性。作者将三种DNA纳米开关与hMGMT酶孵育后测定了其荧光光谱，如图4(c), 4(d)所示，经过甲基转移酶的处理，两种含有O⁶-MeG的纳米开关的FRET信号均有增强，且这种信号响应与加入的甲基转移酶的浓度线性相关。作者再次尝试了SDS-PAGE表征中使用的SsOGT酶以及两种对照酶E. coli Ada-c酶和SsOGT-H⁵酶，结果如图4(f)所示：SsOGT酶与hMGMT酶和阳性对照酶E. coli Ada-c酶结果类似，均可以使FRET信号增强，而阴性对照酶SsOGT-H⁵酶基本不会提高FRET信号，证明了纳米开关用于甲基转移酶活性测定的可行性。

最后，作者使用纳米开关探究了不同抑制剂对甲基转移酶的抑制作用。作者首先使用O⁶-BG作为模型体系，hMGMT酶预先与O⁶-BG孵育后再与纳米开关2-Me Triplex纳米开关孵育时其FRET信号与无甲基转移酶调价下该开关的FRET信号强度基本一致（图5(b)），说明hMGMT酶已被抑制。接下来作者测定了不同浓度O⁶-BG下hMGMT酶被抑制的程度，得到了其IC50值为3.5 ± 2 μM。不同甲基转移酶抑制剂条件下hMGMT酶被抑制的程度也可以通过纳米开关的FRET信号表征，证明了纳米开关用于甲基转移酶活性检测的通用性。

本文作者介绍了一种含有O⁶-MeG碱基的三链DNA纳米开关，该纳米开关可在DNA甲基转移酶的作用下脱去甲基发生构象变化进而产生FRET信号输出。作者通过分子模拟和酶反应实验证明了此纳米开关能够用于DNA甲基转移酶的活性检测，并有望用于高通量抑制剂筛选。由于其高特异性、高灵敏度的特点，该方法也可以应用于多种其他DNA修复酶的活性检测。