今天分享一篇 2020 年发表在 Chemical Communications 上的文章《Degrasyn exhibits antibiotic activity against multi-resistant Staphylococcus aureus by modifying several essential cysteines》。这篇文章的通讯作者为德国慕尼黑工业大学化学系的 Stephan M. Hacker 教授。文章的主要内容是作者通过筛选发现去泛素化酶抑制剂 Degrasyn（ DGS）对多重耐药金黄色葡萄球菌具有抗菌活性，然后基于该实验室开发的 isoDTB-ABPP 方法成功鉴定到了 DGS 可逆共价靶向的半胱氨酸，其中许多半胱氨酸对应的蛋白对金黄色葡萄球菌生存至关重要。

文章内容

    快速耐药是当前抗菌疗法的主要挑战。鉴别新型抗菌药物的一种策略是重新利用最初针对人类蛋白质开发的现有药物。人类去泛素化酶抑制剂degrasyn（DGS）已知具有诱导白血病细胞凋亡的作用；此外其还具有抗感染作用，如减少病毒和单核细胞增多性李斯特杆菌的胞内复制。该课题组在药物抗菌活性筛选过程中，首次发现 DGS 能够杀死耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），最低抑菌浓度（MIC）为6.25μM（图 1B）。令人满意的是，DGS对接受测试的所有MRSA菌株（包括几种临床分离株）均保持了抗菌活性（MIC≤12.5μM）。

图 1（A） DGS结构；（B）DGS对不同菌株金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）值，*表示金黄色葡萄球菌临床分离株；（C）不同取代的DGS衍生物对金黄色葡萄球菌NCTC8325产生的MIC值。

    DGS的构效关系（SAR）表明（图 1C），用苯环替代吡啶环后构建的衍生物5 基本保留了抗菌活性，而苯环再被不同取代基取代则表现出不同的抗菌活性（衍生物5-14），多数活性大大降低（衍生物8-13）。令人满意的是，炔基取代（衍生物15）只略微增加了最低抑菌浓度（MIC），这是使用基于活性的蛋白质分析（ABPP）鉴别 DGS 靶标的先决条件。DGS 结构上最大的特点是具有腈基取代的迈克尔受体（α-氰基丙烯酰胺）这一特征部分，而没有迈克尔受体双键部分的衍生物16 和没有氰基的衍生物17 都没有显示出任何抗生素活性，表明丙烯酰胺和腈基都是DGS抗菌所必须的。

    为了更好地理解 DGS 作用机制，需要对金黄色葡萄球菌进行了靶标鉴定研究。丙烯酰胺本身含有α,β不饱和酮结构，容易与半胱氨酸残基发生不可逆的共价反应，但在α位引入吸电子取代基如腈基后，会导致高度缺电子的烯烃具有可逆共价性，这种通过可逆共价结合靶标的药物对传统的 ABPP 研究发起了挑战。作者将含有炔基的不同浓度衍生物15 作为探针与活菌细胞孵育后裂解，标记的蛋白用“点击化学”方法进行叠氮化的罗丹明或生物素修饰，用于后续的荧光胶成像分析或LC-MS/MS鉴定分析。图 2 结果表明，虽然在荧光胶成像结果中看到一些标记信号，但质谱分析中没有观察到明显的蛋白靶标富集。

图 2. 化合物15在NCTC 8325细胞中所钓取蛋白结果。(A) 结合罗丹明染料后的蛋白荧光成像结果；(B-D) 用25μM (B), 12.5 μM (C) 或6.25 μM (D) 的化合物15在NCTC 8325细胞中所钓取蛋白的火山图结果。

    用不同浓度DGS对探针进行的竞争研究也没有导致一个明显的靶标富集变化（图 3）。因此，可逆共价结合机制不适合传统的ABPP研究，瞬态靶标结合与用于MS检测的富集过程不相容。

图3. 用100 μM (A),62.5 μM (B) and 12.5 μM (C) 的DGS竞争12.5μM化合物15与靶标蛋白的结合，结果用火山图表示。

    近年来，基于半胱氨酸探针的竞争性 ABPP 技术被广泛应用于鉴定活性小分子的半胱氨酸修饰位点，例如2010年 Weerapana 等人发展的基于同位素串联正交及蛋白酶水解活性的蛋白谱（isoTOP-ABPP）技术。但由于在该方法中同位素氨基酸试剂价格高昂以及可切割轻重标签试剂的合成冗长、产率较低，其应用受到了限制。在这篇文章中，该课题组利用自己开发的同位素标记的脱硫生物素叠氮化物（isoDTB）标签（图 4）[1]，基于 isoTOP-ABPP 平台开发了 isoDTB-ABPP 方法作为鉴定可逆共价结合特性药物的靶标的替代策略。由于脱硫生物素仍然与链霉亲和素非常牢固地结合，因此蛋白水解消化之前的所有步骤都可以保持不变。此标签的优势是，脱硫生物素与链霉亲和素的结合具有可逆性，在最后一步中可以在酸性条件下以乙腈为助溶剂轻松洗脱肽，因此不需要设计和合成复杂的可裂解连接子来去除几乎不可逆地与链霉亲和素结合的生物素，简化了化学蛋白质组的工作流程。

图 4. isoDTB 标签的结构

    在这种方法中，金黄色葡萄球菌细胞被裂解后，裂解液被分成两个样品。一个样品用 DGS 处理，另一个样品用 DMSO 处理作为对照（图 5A）。然后，这些样品再加入碘乙酰胺-炔基进行烷基化。竞争性半胱氨酸结合剂如DGS，会在蛋白质组中特定的结合位点阻断这种碘乙酰胺标记。为了读出这两组蛋白烷基化的差异，作者利用“点击化学”技术使样品附加上 isoDTB 标签。然后用链霉亲和素富集后消化。最后利用LC-MS/MS对所得肽段进行鉴定和相对定量。重标（DMSO处理）和轻标（DGS处理）样品之间的比值R表示DGS对特定半胱氨酸修饰的程度。R≈1表示 DGS 与该半胱氨酸没有相互作用；相反，在特定结合位点的半胱氨酸将显示出R ≫1的比率。

图 5（A） isoDTB-ABPP 工作流程；（B）100μM DGS作为竞争剂，碘乙酰胺-炔基作为探针钓取到的蛋白绘制火山图结果；（C）用探针钓取到的半胱氨酸被DGS竞争的程度与DGS 浓度的关系。

    结果表明，在114个 DGS 靶向蛋白中鉴定出151个半胱氨酸，其中 31种标记到的半胱氨酸所属的蛋白质对金黄色葡萄球菌生存至关重要，突出了多药理作用模式（图 5B）。例如，DGS 可以与细胞壁生物合成中起重要作用的双功能蛋白 GlmU 的半胱氨酸 C100 结合；还可以对脂质生物合成所必需的3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶 FabF 的 C165 进行了修饰。因此，DGS 与一些必需蛋白功能相关结合位点上的半胱氨酸残基的相互作用可能是其抗生素活性的主要驱动因素。许多半胱氨酸对DGS处理还有明显的浓度依赖性反应（图 5C），这表明，使用几个不同浓度的共价蛋白配体结合 isoDTB 标签的残基特异性蛋白质组学能够同时提供许多半胱氨酸结合亲和力的可靠信息。

    除了能够获得与未修饰共价蛋白配体结合的残基特异性信息外，这种方法的另一个重要优势是还可以识别与DGS可逆结合的半胱氨酸。在该课题组之前的工作中，已经用19个α-氯乙酰胺配体研究了金黄色葡萄球菌蛋白质组中的哪些半胱氨酸可以被共价配体靶向 [1]。将这些共价配体靶向的半胱氨酸与这次DGS靶向蛋白中鉴定出的151个半胱氨酸（图 5B）比较可知，有96个半胱氨酸并没有被这19个已知的共价α-氯代乙酰胺配体所配位。这表明可逆共价特性的α-氰基丙烯酰胺能与一组独特的半胱氨酸相互作用。

    总结

    综上所述，该课题组筛选出 DGS 是一种新型的抗金黄色葡萄球菌的抗生素活性化合物。因含有α-氰丙烯酰胺结构，该药物与靶标蛋白之间是可逆共价结合，导致整个化学蛋白质组学过程中结合的稳定性有限，因此不能用传统 ABPP 方法进行靶标蛋白共价捕获。该课题组开发的 isoDTB-ABPP 方法被证明是一种很好的补充策略，可以用于鉴定 DGS 等药物在体外可逆共价靶向的半胱氨酸。不足的地方一个是利用竞争性ABPP 技术鉴定到的靶标数量相对来说有限，另一个是是 DGS 显著的人体毒性（IC50=3.4±0.3μM），还需要进一步的结构改造，但通过小分子化合物库筛选获得高抗菌效力的化合物的方法还是很有前景的。

[1] P. R. A. Zanon, L.Lewald and S. M. Hacker, Angew. Chem., Int. Ed.,DOI: 10.1002/anie.201912075.

本文作者：Lianguo Chen

文章地址：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2020/cc/c9cc09204h#!divAbstract