Angew.Chem.Int.Ed.: 亚氨基斯德酮(Iminosydnones)与环炔的生物正交点击和释放反应

  • 144
  • A+

引言

   在复杂化学环境以及不可控制的生物介质中选择性地形成和破坏化学键,是生物材料方向化学家的长期目标。生物正交化学反应恰好应对着这一挑战,因此在化学生物学领域具有重要意义。裂解方法是化学反应中备受瞩目的一个部分,并且基于酸、亲核试剂、氧化剂、还原剂、金属诱导或光诱导等的可裂解部位已经有了充分的开发。尽管基于这些部位的裂解已经实现了很好的应用,但通常这些方法没有能够在保证较好的生物正交性的同时又能实现可以表征和观察的附属连接的反应,限制了它们在生命系统中的使用。因此,开发生物正交点击反应产生不稳定的加合物,同时可以实现其通过键断裂而分解的工作是很有意义的。

成果简介

       2017年,巴黎-萨克雷大学(Université Paris-Saclay)Frédéric Taran教授Angewandte Chemie International Edition期刊上发表了题为Bioorthogonal Click and Release Reaction of Iminosydnones with Cycloalkynes的一篇通讯论文。该研究团队之前报导过发现斯德酮是用于铜催化的末端炔烃环加成的通用偶极子。这些化合物通过初始超表面[3 + 2]环加成反应与环辛炔平稳反应,然后通过逆Diels AlderrDA)反应自发环化,得到环辛烷稠合的吡唑,同时挤出CO2。在这篇论文中,作者探索了介离子化合物对环炔的反应性,以设计新的生物正交反应,允许复合分子的连接和释放,进一步还实现了高生物正交性的半胱氨酸修饰物的链接和裂解同时标记荧光,并在所选取的目标蛋白上实现了验证。

图文解读

1

   作者首先合成了25种中离子化合物的文库(c),并将它们与增加应变的4种环炔A Dd)组合。 相应的100个反应在室温下在HO / DMSO混合物中进行过夜,并通过LC / MS分析(e)。如所预期的,斯德酮1-3号与环炔B-D平稳反应,定量地得到相应的吡唑产物;而环烷烃A没有显示足够的应变以允许有效反应。有趣的是,亚氨基吲哚4对环炔显示出极好的反应性。并且通过NMR光谱进一步研究亚氨基吲哚4和环辛炔B的反应,反应非常干净。二硫鎓化合物15,1819也与环辛炔B进行了比较彻底的反应,但是由于空间原因,更多取代基的炔烃CD没有发生反应。其中用二硫鎓18的反应非常缓慢并且起始中离子化合物在纯水中适度稳定,因此限制了其对生物正交应用的适用性。

2

2

   因此,作者将注意力集中在亚氨基炔酮与环状炔烃的反应上,并研究了介离子化合物结构对反应效率和速度的影响。合成了一系列亚氨基吲哚并作为与双环[6.1.0]壬烯B反应的新偶极子进行测试,其用作模型环辛炔试剂。当化合物Im7与炔B混合时,这两种效应的组合导致直接的点击和释放反应,速率常数为0.18m-1 s-1。该速率与众所周知的菌株促进的叠氮化物炔烃环加成(SPAAC)相当。点击反应通过使用反应性更高的炔CD,反应速率可以显着提高到3.1529.2m-1 s-1

3

3

   上图关于反应速率的结果鼓励着作者进一步探究这种新的点击和释放反应对生物正交蛋白质修饰的适用性。为此,作者合成了亚氨基吲哚Im9作为可切割的双功能构件(a),并通过NMRLC / MS分析证实,Im9和环辛炔BC的反应导致形成预期的吡唑双环产物,其具有与用Im7观察到的速率常数相似的速率常数,并且Im9z在血浆中有足够的稳定性。因此作者在Im9的基础上设计并合成了化合物Im10,其含有i)马来酰亚胺功能,适合与游离半胱氨酸残基缀合;ii)亚氨基斯德酮接头,易被环辛炔生物正交切割;iii)羧基四甲基罗丹明(TAMRA荧光标记。人源化单克隆抗体曲妥珠单抗(T)用作模型蛋白来测试我们的方法。首先用三(2-羧乙基)膦(TCEP)在378℃孵育曲妥珠单抗以使链间二硫键部分还原,然后在48℃用Im10孵育,得到缀合物T1,每个抗体平均含有5.4TAMRA衍生物(b 。为了诱导TAMRA的释放,我们将缀合物T1在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中与1mm环辛炔B溶液一起孵育。通过SDS-PAGE分析所得溶液,其证实了荧光团的完全去缀合(比较泳道12)。并且在血浆中重复试验来测试反应的特异性,也观察到TAMRA的有效释放。并在进一步的实验中得到即使在B浓度低至63 μM时(相当于每个亚氨基斯德酮接头少于2当量的炔烃环B),荧光也是完全释放的。

4

4

   由于现有的几种使用可切割接头的从固定化链霉抗生物素蛋白中回收生物素化蛋白的方法都不具有较高水平的生物正交性。因此作者设计了带有生物素部分的Im11,其通过聚乙二醇(PEG)间隔基将生物素与亚氨基斯德酮分开,并且叠氮化物功能用于CuAAC与炔基化蛋白质的连接(图3a)。作者发现在测试条件下CuAAC反应与亚氨基醌完全正交。应用于在Im11存在下用作模型蛋白的炔基化肌红蛋白(MyoAlk)的CuAAC条件提供了生物素化的肌红蛋白(MyoBiot),其易于被链霉抗生物素蛋白珠捕获(c)。除去捕获和上清液后,通过加入市售的荧光环辛炔26500 μM25℃,1小时),从链霉抗生物素蛋白珠中平稳地释放MyoBiot。结果表明MyoBiot定量捕获并转化为荧光标记的肌红蛋白MyoTAMRAc,泳道2)。作者将相同的设计应用于在肝脏提取物中混合的MyoBiot,也能观察到支持的肌红蛋白的选择性和有效释放和反式标记,从而允许蛋白质的定量回收和标记(c,泳道4)。该结果证实了亚氨基醌基序的高选择性和生物正交性,并突出了其在复杂生物介质(例如肝脏提取物)中的稳定性。

总结与展望

   本文报告了一种新的生物正交点击和裂解反应,涉及亚氨基斯德酮和应变炔烃。该转化导致在生理条件下由亚氨基炔酮连接和断裂产生的两种产物。优化的亚氨基胍成功用于设计蛋白质修饰的创新可切割接头,从而开辟了药物释放和捕捞目标领域的新领域。这种点击和释放技术为温和生物正交条件下在功能化的环辛炔的蛋白质上交换标签提供了可能性。

文献链接

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.201708790

团队介绍

本文通讯作者Frédéric Taran

研究方向:生物有机化学和标记服务

地址:DRF-JOLIOT-SCBM, CEA, Université Paris-Saclay  91191 Gif-surYvette(France)

E-mail: frederic.taran@cea.fr

作者主页:

https://www.researchgate.net/profile/Frederic_Taran


weinxin
我的微信
关注我了解更多内容

发表评论

目前评论: