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供稿：熊军，武汉大学
校稿：陶皖兵、陈滢滢、袁必锋，武汉大学
推送：陶皖兵，武汉大学
大家好，今天分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，题目是Development of an Endonuclease V-Assisted Analytical Method for Sequencing Analysis of Deoxyinosine in DNA，通讯作者是来自湖南大学化学化工学院的代晓霞教授和游常军教授。在本研究中，作者开发了一种内切酶V（EndoV）辅助的DNA中脱氧肌苷（dI）的定位分析方法。 图1 dI是DNA中脱氧腺苷（dA）的脱氨产物，可通过自发水解、亚硝酸盐氧化和腺苷脱氨酶催化产生。此外，DNA中的dI还可能是由于DNA复制过程中三磷酸脱氧肌苷（dITP）误掺入而产生的。当细胞内嘌呤核苷代谢被阻断时，dITP不能在细胞核苷酸池中转化为单磷酸脱氧肌苷（dIMP），这可能导致基因组中dI增加。由于dI的结构与脱氧鸟苷（dG）非常相似，因此dI优先与脱氧胞苷（dC）配对，导致发生A到G的突变，最终可能导致癌症等疾病的发生。 图2 DNA中dI的生成途径 DNA中的dI主要通过两种机制进行修复，即碱基切除修复和替代切除修复（AER）。研究最广泛的AER途径是由大肠杆菌EndoV介导的。EndoV切割dI的3′端磷酸二酯键，此外，AER还需要利用大肠杆菌DNA聚合酶I（Pol I）和大肠杆菌DNA连接酶（DNA ligase）来完成碱基的修复。大肠杆菌Pol I的外切酶活性能够使其去除dI的下一个碱基。 鉴于dI在癌症发生中起致病作用的原因，开发用于检测DNA中这种损伤产物的分析技术非常重要。目前，有多种测量方法已用于研究DNA中的dI，包括气相色谱-质谱，液相色谱-质谱（LC/MS）和液相色谱串联质谱（LC/MS-MS），然而，这些基于质谱的分析方法不能提供dI位置信息。 在本研究中，作者开发了一种方法，即dI-seq，用于定位DNA dI的修饰位点，该方法利用EndoV特异性切割dI，并通过Pol I产生一个2 nt的缺口。接下来，利用DNA ligase将Biotin-dATP掺入DNA中，从而通过亲和富集完成对dI的测序（图3）。 图3 EndoV辅助的dI-seq方法示意图 首先，作者利用合成的含dI修饰的质粒验证了dI-seq方法的准确性。作者将合成的含dI修饰的质粒用EndoV和Pol I处理，产生一个2 nt的缺口，然后加入DNA ligase，Biotin-dATP，dTTP，dCTP，dGTP和ATP。对生物素标记的DNA修复产物进行纯化并利用链霉亲和素珠富集，最后进行文库构建和测序分析（图4a）。 作者评估了碱基取代频率，即用EndoV修复之前和之后dI修饰位点的碱基分布。定量数据显示，dI在EndoV修复前以49%的频率诱导A→G突变，而EndoV修复后导致A→G突变频率大幅降低（∼27%）（图4b）。这些结果表明，EndoV辅助分析方法可以作为DNA中dI修饰位点位置检测的快速分析方法。 图4 基于dI-seq的质粒DNA中dI修饰测序分析 接下来，作者应用EndoV辅助的dI-seq方法来探索人类线粒体DNA中dI修饰位点的分布。dI测序图谱结果显示线粒体DNA中有多个dI修饰位点（p<0.01），包括ND1，COI，COII，COIII，ND2，ND4，CYTB，D-loop和12S rRNA区域（图5）。 图5 人类线粒体DNA中dI分布的Circos图 鉴于EndoV依赖的dI修复途径涉及产生2 nt缺口，如果缺口为AA序列，则在 dI-seq 期间，两个Biotin-dATP核苷酸可能被掺入该缺口中。在已报道的dU-seq方法中，类似地，采用Biotin-dUTP结合UDG糖苷酶和Bst聚合酶能够在模板链中dU损伤位点的∼10个核苷酸内掺入新合成的碱基，相比于单个生物素标记的DNA片段，2个或多个生物素标记能够保证损伤修饰的富集效率更高。因此，结合使用Bst DNA聚合酶，EndoV辅助dI-seq方法可用于掺入多个生物素标记，从而更有效地富集dI DNA。 值得注意的是，与其他基于DNA修复酶的测序方法一样，EndoV 辅助的dI-seq 方法在特异性方面也可能受到限制，这种DNA修复酶也可能在其他DNA损伤中发挥作用，但程度要小得多，需要进一步研究评估这种低概率的切割是否会影响全基因组测序结果，以及优化EndoV辅助的dI-seq方法或开发替代方法来预防或减轻酶特异性的潜在影响。尽管如此，本文开发的dI-seq方法对于了解修复酶相关DNA损伤和癌症形成的生物学意义具有重要价值。 综上所述，本文开发了一种用于DNA中dI修饰的测序分析方法，利用该方法实现了对含dI修饰的质粒DNA中修饰位点的有效鉴定，并应用该方法成功检测并鉴定了人类细胞线粒体DNA中的dI修饰位点。EndoV辅助分析方法的发展为人类等基因组DNA中dI修饰位点的测序分析迈出了重要的一步。 文章编号：70 原文链接： https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.2c02126 原文引用：
Xiaofang Zheng, Di Chen, Yingqi Zhao, Xiaoxia Dai, and Changjun You. (2022), Development of an Endonuclease V-Assisted Analytical Method for Sequencing Analysis of Deoxyinosine in DNA. Anal Chem, DOI: 10.1021/acs.analchem.2c02126.
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