给大家分享一篇发表在J. Am. Chem. Soc.上的工作，题为：Nonenzymatic Stereoselective S-Glycosylation of Polypeptides and Proteins。该工作的通讯作者是来自四川大学的钮大文教授。

多肽与蛋白质的糖基化在病毒感染、免疫反应和癌症转移等生物过程中起着关键作用。在天然糖蛋白中，糖类分子通常连接在丝氨酸/苏氨酸的羟基或天门冬酰胺的氨基上，相比之下半胱氨酸残基上的S-糖基化则较为少见。但由于氧和硫原子之间的相似性，S-修饰糖肽往往表现出与O-修饰糖肽类似的结构特征与生物活性。同时，S-修饰糖肽对化学水解和酶降解具有相当大的抗性，因此在生物系统中具有较长的寿命。由于上述优点，S-修饰糖肽在生物研究中作为药物或天然O-修饰糖肽的模拟物引起了极大的关注，因此发展快速、选择性的S-修饰糖肽和糖蛋白制备方法具有重要意义。半胱氨酸由于其高亲核性，在蛋白质修饰中发挥着重要作用，但传统的糖基亲电试剂很少能与水介质相容，修饰过程中也常常伴随着半胱氨酸的消旋副反应，因而给S-修饰糖肽的制备带来较大挑战。本文中，作者设计了一种能够在水介质中产生糖基自由基的新型烯丙基糖基砜类分子，并且实现了对一系列具有生物功能的多肽/蛋白质底物高效、简便的糖基化修饰（图1）。

图1. 基于半胱氨酸巯基的多肽/蛋白质糖基化修饰示意图

如图2所示，作者展示了糖基化修饰的反应路径，底物6中的游离巯基首先被转化为二硫化合物7，化合物7中的二硫键发挥着双重作用：既能启动糖基自由基的生成，又能捕获糖基自由基。具体来说，分子7中的二硫键发生均裂产生一个巯基自由基8，8与烯丙基糖基砜分子1上的双键反应生成烷基自由基2，烷基自由基2发生异构化，释放SO₂和烯丙基硫化物3，从而生成关键的糖基自由基4，而二硫键7能够捕获自由基4，获得目标产物S-糖肽，并使巯基自由基再生，进入下一反应循环。

图2. 糖基化修饰的反应路径

基于上述反应机理，作者首先研究了乙酰基保护的烯丙基糖基砜类分子与二硫键小分子的光催化模型反应，通过对底物取代基的筛选，作者发现化合物9上的R₁取代基对于转化率有显著影响，而分子10的R₂基团对于反应转化率影响较小，而体系暴露在空气中或者加入TEMPO则会导致反应效率下降，表明该反应以自由基的机理进行。另外，作者展示了使用更便宜的有机染料分子Eosin Y也可以实现反应，具有良好的经济性和生物安全性（图3）。

图3. 糖基化模型反应的条件优化

考虑到糖肽分子脱保护较为困难，作者尝试直接利用非保护的烯丙基糖基砜分子对多肽分子进行后修饰，如图4所示，该体系能够实现糖基分子（半乳糖、甘露糖、阿拉伯吡喃糖等）对一系列具有重要生物功能的肽分子的高效、立体选择性后修饰，表现出较好的普适性。

图4. 糖基化反应的底物拓展

作者也指出上述方法需要预先将半胱氨酸巯基转化为二硫键方能完成后续反应，同时反应之后需要除去硫醚分子副产物。为了避免上述繁琐的反应过程，如图5所示，作者使用异噻唑啉酮实现了巯基到二硫键的原位快速转化，并且有效避免了副产物的生成。基于反应的简便性、快速性与试剂的稳定性，作者将糖基砜分子、异噻唑啉酮与荧光分子Eosin Y混合制备成一种易于操作的糖基化试剂盒，并且展示了将亲和体(affibody)蛋白分子与糖基化试剂盒光照下简单混合1h左右即可实现较好的定点糖基化修饰。

图5.“第二代”糖基化反应与蛋白质糖基化效果展示

综上所述，作者开发了一种在生物相容条件下进行S-糖基化的简便而通用的方法。该方法的关键在于设计稳定的烯丙基糖基砜类分子作为糖基自由基的前体，在光催化条件下，糖基砜分子与半胱氨酸生成的二硫化物反应形成半胱氨酸-糖基化合物。通过设计和使用异噻唑啉酮作为半胱氨酸的硫代试剂，作者进一步简化了操作，提高了方法的效率。作者预计这种具有通用性和简便性的方法将很快被用于S-糖基化合物的制备，并在化学、生物学、药物发现和材料科学中发挥用途。

作者：XW    审校：LCY

DOI: 10.1021/jacs.1c05156

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c05156