位点选择性蛋白质修饰技术适用于对给定反应性部分的广谱化学蛋白质组学研究^[1]，可以发现具有生物学意义的新位点，并最终发现新的可药用位点。许多化学蛋白质组学分析策略都是利用亲电子试剂针对强亲核物质，如半胱氨酸或中等至弱亲核性的高丰度残基，如赖氨酸、丝氨酸/苏氨酸、酪氨酸和天冬氨酸/谷氨酸。然而，针对其他具有重要功能的残基（例如色氨酸(Trp)）的亲电子方法仍然是一个挑战，主要源于Trp非常低的天然丰度和其吲哚侧链的适度亲核性的组合^[2]。

怀俄明大学Michael T. Taylor教授团队基于之前的工作，提出了一种使用可见光对色氨酸修饰的选择性探针，相关成果发表于jacs，标题为：Donor−Acceptor Pyridinium Salts for Photo-Induced Electron- Transfer-Driven Modification of Tryptophan in Peptides, Proteins, and Proteomes Using Visible Light。

图1 色氨酸修饰的一系列方法

作者最近报道了一种Trp修饰方法，该方法^[3]使用了N-氨基甲酰基吡啶盐(1)，该盐在302nm照射下，通过自由基断裂/重组过程与Trp选择性耦合（图1B）。该反应对色氨酸显示出良好的选择性，反应时间也很短。但是使用过滤UV-B光作为辐照源是有一定挑战的，并且UV-B（波长＜300nm）光诱导可能会导致蛋白质的光降解。而通过调整1的结构可以实现1的专有光激发（Trp→[1]*，Trp充当还原猝灭剂），该方法可以修饰光不稳定的蛋白质。因此作者扩展1的π-共轭，以期使用可见光谱实现1的直接光激发（图1C）。

图 2 探针 2a 的设计与表征

基于这些考虑，作者开发了吡啶鎓支架2，它具有一个富含电子的6-甲氧基萘环。这种结构既能缓和2的光氧化电位，又能将模型探针2a的吸光度红移至450nm以上（图2A），因此能够用简单的蓝色和紫色LED进行光激活。用427nmLED照射溶菌酶60分钟的有效标记转化率>95%（图2B）。与探针(1)相比，2a有效标记蛋白质的浓度低一个数量级，同时提供可见光的光学触发。另外时间控制实验验证了光对实现标记的必要性（图2D）。2a与Trp类似物N-乙酰色氨酸(NATA)的荧光猝灭的Stern-Volmer图呈现线性相关性，表明[2a]*与Trp的动态猝灭（图2C）。化合物2a显示出与光激发状态下的显著电荷转移相关的溶剂化显色特性，激发时电荷由萘基向吡啶鎓转移，采用共面取向（图2E)。

图 3 探针2对肽和蛋白质的修饰

接下来，作者试图探索标记过程的范围，使用了一组含有色氨酸的肽和蛋白质（图3A）。艾塞那肽•OAc是一种4.2kDa的多肽，它的骨架部分掩盖了它的单个色氨酸残基，其转化率仍然达到70%。硫氧还蛋白(Trx)的照射Trp-31处实现Trp标记。接下来探索了β2-微球蛋白(B2M)的标记，它具有两个Trp残基，一个完全暴露于溶剂，一个大部分被掩埋，用2a照射B2M30分钟导致在溶剂暴露的Trp-60上几乎完全单标记。对胰凝乳蛋白酶原A和牛碳酸酐酶II(CAII)的研究也与上述情况类似。总之，这些结果确定了2a在一系列环境中对Trp的选择性。研究肽和蛋白质中每个Trp残基的溶剂可及性并与修饰位点进行比较，结果表明当存在多种选择时，2a通常选择溶剂可及性最高的残基（图3B）。

之后，作者使用2将有用的功能转移到色氨酸残基（图3C）。发现亲和标签如生物素(2b)以82%的转化率有效地转移到溶菌酶上，而且用2b进行蛋白质标记的速度比用2a快得多。与2a相比，叠氮化物探针2d也显示出更高的速率。

图 4 探针应用于蛋白质组学分析

接下来还评估了探针2在化学蛋白质组学分析中的能力。作者组装了三个生物素化的Trp探针2b、1a和1b。裂解物与探针孵育60分钟，随后用特定波长光源照射20分钟（图4A）。使用链霉亲和素-HRP对探针1a、1b和2b进行蛋白质印迹分析，表明每个探针都显示出浓度和光学相关的蛋白质组标记曲线（图4B）。在富集和消化后，LC/MS-MS分析鉴定出185种具有1a的蛋白质、365种具有1b的蛋白质和523种具有2b的蛋白质，2b具有最高百分比（图4C、4D）。对显示2b富集的蛋白质与实验中检测到的所有蛋白质进行了富集分析（图4E）。分析表明伴侣蛋白和异构酶蛋白在背景下具有特别高的富集度。图4F则清楚地说明了该探针的光诱导反应性及其在没有光的情况下的热惰性。

总之，作者开发了一种供体-受体吡啶鎓盐支架，它能够使用可见光对蛋白质进行PET驱动的Trp修饰，同时保持了良好的转化率和选择性。探针可以在化学蛋白质组学中发挥作用，既能够探测不具有传统亲核残基的配位点，又能够探索色氨酸的原位化学行为。

【文章链接】

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c10536

【DOI号】

10.1021/jacs.1c10536

【参考文献】

[1]Maurais, A. J.; Weerapana, E. Reactive-cysteine profiling for drug discovery. Curr. Opin. Chem. Biol. 2019, 50, 29−36.

[2]Lakhdar, S.; Westermaier, M.; Terrier, F.; Goumont, R.; Boubaker, T.; Ofial, A. R.; Mayr, H. Nucleophilic Reactivities of Indoles. J. Org. Chem. 2006, 71, 9088−9095.

[3]Tower, S. J.; Hetcher, W. J.; Myers, T. E.; Kuehl, N. J.; Taylor, M. T. Selective Modification of Tryptophan Residues in Peptides and Proteins Using a Biomimetic Electron Transfer Process. J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 9112−9118.

【本文作者】

曹祯媛

黄硕课题组硕士生