分享一篇刚刚发表在J.Am. Chem. Soc.上的文章，文章的题目是“An Ionic Liquid Medium EnablesDevelopment of a Phosphine-Mediated Amine-Azide Bioconjugation Method”( J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 12974-12979 )。该文的通讯作者是北卡罗来纳州立大学的Jun Ohata助理教授，其研究兴趣集中于天然蛋白质的特异性位点修饰、新型蛋白质翻译后修饰的化学反应以及非传统生物介质的开发。虽然一系列不同设计策略已经产生了多种化学工具用于在水中进行生物分子标记，但是用于生物偶联的非水、生物分子相容介质的开发明显滞后。离子液体具有特定的组成结构，介于水相和有机相之间，既具有生物大分子等的兼容性，又具有有机反应的兼容性，已被广泛在各种领域（比如MOFs、COFs的合成、CO2高效催化等）作为有机溶剂的替代品，已有证据表明各种生物分子在离子液体中比水溶液具有更高热稳定性。虽然离子液体已广泛地研究和使用，尚未有使用离子液体进行蛋白质生物偶联的相关报道。本文，作者证明非质子离子液体在不引起生物分子功能的丧失的前提下，可作为蛋白质生物偶联的新型反应溶剂。在该离子液体生物偶联方法的建立下，作者发现了一种新的三苯基膦介导的胺-叠氮化物偶联反应（即在未受保护的肽和蛋白质上形成稳定的四氮烯键）。该非传统介质离子液体的使用为扩大生物偶联化学方法的范围提供机会。离子液体种类繁多，作者通过文献调研选取1-丁基-1-甲基吡咯烷三氟甲磺酸盐 (BMPy OTf)作为离子液体，已有文献报道该非质子型的离子液体不仅有良好的化学稳定性而且能够稳定蛋白质。使用BMPy OTf作为介质，作者发现三苯基膦可以催化蛋白质氨基与烷基叠氮化合物的偶联反应（图1A）。首先，作者使用血管紧张素II肽与烷基叠氮化合物验证反应可行性，并使用MALDI-MS以及NMR等手段验证了偶联反应的成功实现（图1B）及四氮烯产物的生成（图1C）。其次，作者将此类反应进一步拓展到其它多种多肽底物上，发现该反应具有高转化率、高兼容性（可兼容咪唑、胍基、氨基甲酸酯、羟基等官能团）、以及对烷基胺的高特异选择性（图2A）。图1、(A)离子液体中的三苯基膦 (PPh3)介导的四氮杂的胺-叠氮化物偶联反应示图。(B) 离子液体与生物分子及有机反应相容性示意图。 (C) 不同的介质中MALDI-MS监测分析血管紧张素 II 肽与叠氮化物 1 和 PPh3的反应。 (D)四氮烯的 15N NMR 分析。
进一步作者验证了四氮烯形成反应可易于对HIV 融合抑制剂 enfuvirtide、溶菌酶、α-糜蛋白酶原 A 和链霉亲和素等模型蛋白底物进行化学修饰（图 3A）。蛋白质的动力学分析表明，不到 1 小时该反应即可完成（图 3B）。值得注意的是，即使在用离子液体处理蛋白质后，蛋白质活性依然保留。选择链霉亲和素与生物素的结合作为模型，蛋白质暴露于叠氮化物和含有膦试剂的不同类型介质后，经缓冲液交换，测量链霉亲和素与生物素荧光团的结合能力。在缓冲液和离子液体处理条件下观察到来自结合的荧光信号，而用高浓度有机溶剂的浓度（>90% DMF 或 DMSO）作为以及变性剂（十二烷基硫酸钠，SDS）/热处理的样品几乎没有提供荧光信号（图 3E), 证明了离子液体和与这种蛋白质底物的四氮形成反应具有生物相容性。最后，作者进一步深化将此生物偶联反应运用到分子量更大/结构更复杂的抗体-药物偶联方面，成功实现了曲妥珠单抗与拓扑异构酶抑制剂SN-38的偶联且不影响抗体对抗原的识别。
图3、保持蛋白质活性的下的四氮形成反应。(A) 由叠氮试剂修饰蛋白质的结构。(B)修饰的抗生物素蛋白质印迹α-胰凝乳蛋白酶原 A 与生物素叠氮化物在不同时间点的荧光强度。（C）花青基叠氮化物 3 (Cy3-azide) 的结构和凝胶荧光用。(E)不同介质中链霉亲和素孵育与生物素-荧光素在四氮烯形成反应后的荧光强度。
总结，作者首次运用运用离子液体作为生物偶联反应基质，拓宽了非水溶剂下生物偶联反应的范围，具有非常广阔的应用前景。
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