推荐一篇发表在JACS上的文章Site-Specific Protein Labeling and Generation of Defined Ubiquitin-Protein Conjugates Using an Asparaginyl Endopeptidase，本文的通讯作者是来自瑞士苏黎世联邦理工学院有机化学实验室的Kathrin Lang教授。她们实验室的主要研究利用非天然氨基酸插入的遗传手段，开发适合生理调节的新的化学工具，以研究或调控生物过程。
在蛋白质中使用各种具有位点特异性的探针对蛋白进行标记，可以生成各种蛋白蛋白的偶联产物，在研究蛋白质的生物学功能以及开发治疗性和诊断性生物偶联物方面有很大的研究前景。但是在温和的条件下，在想要的位置插入蛋白质修饰仍然是一个巨大的挑战。利用化学酶标记方法，可以在温和条件下将探针加载在识别序列内的氨基酸侧链。天冬酰胺内肽酶（Asparaginyl endopeptide ases, AEPs）近年来被广泛应用于多肽和蛋白质的修饰。其中建立的工程AEP OaAEP1，由于它的高效的催化效率和最小的识别motif，成为一种理想蛋白质标记方法。它能在NGL三肽识别motif内切割天冬酰胺或者天冬氨酸残基的C端，形成一种硫酯中间体，该中间体可通过适当的亲核试剂（例如，N端的α-氨基酸）的攻击来分解，产生连接产物。然而，这种标记仅限于蛋白质的末端，严重限制了创建治疗和诊断应用所需要的各种偶联物的灵活性和范围。本篇文章希望可以实现在蛋白质的内部对蛋白质进行标记，所以作者想要结合OaAEP1介导的转肽功能和非天然氨基酸的遗传编码技术，在特异位点连接双甘氨酸片段（GGisoK）。
作者首先对OaAEP1对亲和受体的耐受性和特异性进行了评估，这些亲和受体可以通过遗传密码扩展技术，以非天然氨基酸的形式位点特异性地整合到蛋白质中，最近作者已经证明了可以利用遗传编码AzGGisoK的方法，在任何POI上的赖氨酸的ε-氨基上加入一个GG的二肽片段。实验发现GGisoK也可以利用OaAEP1进行转肽，但是85%的转肽效率需要18h。但是这种连接产物的水解率较低。作者随后检测了含GgisoK的蛋白是否也可以做为OaAEP1介导的转肽的潜在亲和试剂，作者首先利用先前报道的选择性吡咯基-tRNA合成酶衍生的AzGGisoKRS/tRNA CUA进行引入。AzGGisoK修饰的蛋白的叠氮部分可以很容易通过施陶丁格还原反应得到相应的胺类似物。利用这种方式，作者表达了带有GGisoK的K48的Ub产物（Ub-K48GGisoK）。同时，作者也合成了一个带有脱硫生物素的NGL探针。
因为反应的速率太慢，所以作者通过分析，发现副产物与所需的GgisoK亲和试剂发生了竞争。所以作者利用C端组氨酸扩展的dtb-NGL，释放GLH，从而被络合，隔离竞争亲和受体。该方法大大提高了标记效率。作者最终实现了在30℃，1h的条件下，生成了超过80%的标记蛋白。随后作者又实现了在蛋白内部以及蛋白C端的顺序性双标记，以及在GFP上的自定义位点的标记。最后作者认为可以利用该方法构建Ub-poi的偶联物，该偶联物与天然的相比只是在Ub的C端存在一个点突变。作者在Ub的C端表达了带有RLNGLH序列的泛素分子（Ub(N)），0.04μM的OaAEP1存在下，将Ub-k48GGisoK与5倍多的Ub(N)共同孵育，15分钟内可以得到K48连接的diUb。作者还尝试了其他位置的泛素化修饰。实验发现OaAEP1介导的泛素化具有普适性。
总之，本篇文章利用遗传密码扩展技术和AEP介导的转肽作用，成功实现了在蛋白内部的标记，并利用该方法，成功对蛋白的特定位置加入泛素链。
本文作者：WYK
责任编辑：JGG
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.2c02191
文章引用：DOI：10.1021/jacs.2c02191
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