给大家分享一篇近期发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，文章的题目是Site-Selective Functionalization of Methionine Residues via PhotoredoxCatalysis. 本文的作者是美国普林斯顿大学化学系教授David W.C. MacMillan。

蛋白质固有的结构复杂性使得蛋白质选择性修饰策略的发展成为化学生物学中的一个重要挑战。传统的生物共轭方法依赖于亲核氨基酸残基和小分子亲电分子之间的取代反应，以共价连接蛋白质上特定位置的生物有效载荷。光氧化还原的策略，也就是可见光的光子能量被光催化剂捕获并作为电化学电位传递。单电子转移(SET)是通过氨基酸氧化电位，选择性地靶向特定残基，产生反应性开壳自由基中间体，使其他残基完整。关键的是，光氧化还原催化的温和和高度选择性，以及它与生物条件的兼容性，使它成为开发新的生物共轭技术的理想平台。

 在传统的亲核性反应范式下，蛋氨酸由于硫醚侧链的明显疏水性和弱亲核性，其生物结合是极具有挑战性的。然而，蛋氨酸很容易氧化，使它可能容易通过光氧化还原催化功能化。最近有报道使用化学选择性硫氧化试剂将硫醚部分转化为磺胺嘧啶或α-偶氮砜离子的蛋氨酸选择性生物共轭方法，这些开创性研究可能具有广泛的药物应用。

作者设想通过光氧化还原策略首先激发光催化剂实现硫的单电子氧化，然后进行α-去质子化以产生以碳为中心的α-硫自由基。然后，这种亲核自由基可以与SOMO（SOMO是单电子填充最高占据轨道）亲烷基化试剂反应。与其他基于硫醚修饰发生在硫原子的蛋氨酸修饰的方法相比，作者提出的方法涉及到与相邻碳的共轭，以不可逆转地提供稳定的共轭产物（如图1）。

图1 光氧化还原催化甲硫氨酸选择性生物共轭法的研究进展

首先，作者在蓝光下，在水溶性光催化剂存在下，研究了四肽VMFP（1）与亚乙基丙二酸二乙酯（2）在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.4)中的结合（如图2）。首先作者探索了一些光催化剂，铱和钌基配合物以及有机染料，导致了一种不理想的蛋氨酸亚砜产品生成，作者把注意力转向了光催化剂的黄素家族。作者假设，通过SET对黄素三重态激发态进行猝灭后，得到的还原黄素自由基阴离子可以作为碱基，去质子化与硫自由基阳离子相邻的位置，从而产生所需的α-硫自由基物种。令人欣慰的是，光黄素（3）在光催化条件下有效地催化了转化，产生了所需的蛋氨酸共轭产物4，转化率为79%，而没有明显的蛋氨酸亚砜副产物的形成。

图2 蛋氨酸与黄素光催化剂的烷基化反应条件

黄素催化蛋氨酸生物共轭的机理如图3所示。最初，基态光黄素(1LF，3)的光激发产生长寿命三重态激发态(3LF，6)。这种高氧化激发态能够用蛋氨酸硫醚进行SET。光黄素自由基阴离子(LF−，8在得到的蛋氨酸自由基阳离子7的α位置的脱质子后提供了α-硫代自由基9和光黄素的稳定还原形式(HLF，10)。 亲核碳中心自由基中间体9然后加入Michael受体2，得到α酰基自由基11。 自由基中间体11和氢原子供体10之间的氢原子转移(HAT)再生基态光黄素3，并提供蛋氨酸共轭产物12。

图3 蛋氨酸与黄素光催化剂的烷基化反应机理

作者接下来把注意力转向探索迈克尔受体组分的范围（表1）。选择含有蛋氨酸残基的丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶作为模型蛋白底物。结果显示光催化共轭可以容纳Michael受体组分上的一系列官能团，允许引入与传统的亲核生物共轭协议不兼容的有用的功能手柄。

表1 光氧化还原蛋氨酸选择性烷基化迈克尔受体范围

接下来，作者试图评估该策略在不同分子量的不同范围的蛋白质底物上的通用性和位点选择性。结果显示有较好的通用性和位点选择性并且该方法还能够标记核糖核酸酶A（25）且转化率大于43。

然后，作者然后开始评估光氧化还原生物结合在一个生物系统的背景下，以探讨该策略否能够在温和的条件下修饰蛋白质，而不改变三级结构。选择增强绿色荧光蛋白(EGFP)作为本研究的模型底物。如图5a所示，目的是通过将Michael受体17与EGFP结合来安装炔官能团。然后，炔将作为一个手柄，通过铜催化的炔−叠氮环加成(CuAAC)进一步功能化的蛋白质。在实践中，10μM EGFP暴露于标准反应条件下，形成EGFP−炔共轭物26，转化率为45。由于EGFP已知会由于变性或光漂白而失去其活性，因此对产品的荧光水平进行了测量，以验证其蛋白质功能完整性,值得注意的是，作者观察到95%的荧光相对于野生型EGFP(图5c)。EGFP−炔共轭物26容易接受CuAAC，这有助于安装目标生物基序。生物素叠氮化物27和九聚精氨酸叠氮化物28都成功地应用于这一转化，提供了相应的EGFP−生物素和EGFP−(Arg)₉加合物(图5b)。我们通过链霉亲和素免疫组化染色证实生物素标记附着在EGFP上(图5d)。为了验证非精氨酸标记的附着性，用EGFP−(Arg)₉处理SJSA-1细胞，并用共聚焦显微镜观察。由于九聚精氨酸肽有助于将货物蛋白传递到细胞中，所以只有EGFP−(Arg)₉共轭物被内化(图5e)。正如预期的那样，在未修饰的EGFP或EGFP−炔结合物26处理的细胞中没有观察到明显的内化。这些结果突出了光催化生物结合方法的能力，使快速蛋氨酸选择性结合和将生物有效载荷传递到细胞中。

图5 通过光氧化还原蛋氨酸生物共轭策略实现EGFP的功能化。(a) EGFP最初用17标记，然后通过CuAAC将含有生物基序的叠氮化物附加到修饰的EGFP中。(b) 含有生物素标记和九聚精氨酸肽的叠氮化合物。(c)通过光氧化还原蛋氨酸生物共轭策略对EGFP进行功能化后，该产品相对于野生型EGFP保留了95%的荧光(n=3，平均±SD)。(d) 野生型EGFP和改良EGFP的蛋白质印迹图像。(e) 用EGFP、EGFP−炔和EGFP(Arg)9处理的SJSA-1细胞的共焦显微镜图像。标尺=20μm。

作者开发了一种位点选择性蛋氨酸生物结合策略，使用光激发产生开壳中间体。这种还原-电位门控策略使人们能够对传统的亲核结合方法中不可用的残基进行探究。为了证明这一新策略的通用性和稳定性，作者修饰了多种蛋白质，并进一步利用这一功能手柄来附加不同的生物有效载荷。这种蛋氨酸结合策略的成功发展将加强光氧化还原催化在促进复杂生物分子的温和、选择性和稳定的功能化方面的效用。