文献分享来自JACS上的工作，题目为“Steric-Free Bioorthogonal Labeling of Acetylation Substrates Based on a Fluorine−Thiol Displacement Reaction ”，文章的通讯作者是美国天普大学的Rongsheng E. Wang，其小组开发了一种新型的生物正交反应，报道了一种基于氟-硫醇置换反应对乙酰转移酶底物进行标记的新方法。

生物正交反应极大促进了复杂生物系统中蛋白的标记，提高了我们对包括翻译后修饰在内的许多重要生物途径的理解。然而，目前的许多化学报告基团的尺寸都很大，这种内在的空间位阻在很大程度上限制了报告基团在具有广阔活性位点口袋的酶代谢中的应用。本篇工作开发了一种新的生物正交反应，可以选择性替换掉酰胺键α位的氟原子。这种氟-硫醇置换反应（fluorine−thiol displacement reaction , FTDR）可以劫持体外或活细胞中乙酰转移酶介导的乙酰化反应，并进一步转化为生物素或荧光标记，提供了一个对乙酰化底物进行常规检测和成像的策略。

氟原子具有较好的生物正交性，由于大小与氢原子相似，且乙酰胺中的碳-氟键与碳-氢键的长度相当（图1A），因此作者选择乙酰化作为概念证明，研究氟化乙酰辅酶A（F-Ac-CoA）是否能够劫持乙酰转移酶介导的CoA代谢，从而对其蛋白质或肽底物进行有效标记（图1B）。结果表明，乙酰基上的氟修饰提供了相对无空间位阻的化学报告基团，可以成功标记乙酰转移酶的底物（图1C）。

图1  Ac-CoA类似物通过乙酰转移酶标记乙酰化底物

接下来，作者尝试用其他标记物如荧光染料或生物素对氟乙酰胺进行进一步修饰。相关研究表明，α-氟乙酰苯可以被掺入到蛋白质中，观察其与附近半胱氨酸的反应^[1]。因此，作者猜想氟化乙酰基团可能与硫醇衍生物反应。为了验证假设，作者选用一系列苯硫醇衍生物与氟乙酰胺进行反应（图2A），发现邻位和对位的供电子基团通过增加亲核性促进了氟-硫醇置换反应（FTDR），其中，化合物13（三甲氧基类似物）是反应活性最高的硫醇衍生物，可在13 h内达到81%的转化率（图2B）。

图2  苯硫醇衍生物结构-反应活性关系

有了最具活性的苯硫醇衍生物，作者构建了一个生物素探针（14，Biotin-SH）对组蛋白H3.1实施标记（图3A）。首先将蛋白底物与F-Ac-CoA在标准体外酶反应条件下孵育，得到氟化乙酰蛋白，再将混合物与biotin-SH探针孵育，随后进行凝胶内荧光成像以检测生物素标记。由图3B可知，孵育1小时内，组蛋白发生了有效生物素化，并在3小时内逐渐达到饱和。此外，非组蛋白底物EZH2在组蛋白相同的反应条件下也发生了类似的标记（图3C），显示了使用FTDR反应对一系列已知蛋白质底物进行无位阻体外标记的优势。

图3  用biotin-SH探针标记蛋白质底物

为了探索该探测系统标记活细胞中蛋白质的能力，作者设计了氟化的前代谢物，它在细胞系中显示出低细胞毒性，且可以在活细胞中被酶转化为氟乙酰-CoA。作者用前代谢物对HeLa和HEK293细胞系进行处理，然后用TAMRA-SH探针（化合物15）进行FTDR反应（图4A），用叠氮基修饰的前代谢物和相应的TAMRA探针（化合物16）作为平行对照。直接显微镜成像研究显示（图4B）， FTDR方法显示了更强的细胞内标记。类似地，在经历完整的两步FTDR过程的细胞裂解物的标记反应中，可以观察到跨越宽分子量的多个标记蛋白质条带（图4C），充分证明了FTDR在细胞环境下分析乙酰化蛋白质组底物的能力。

图4  用TAMRA-SH探针标记细胞

为了进一步证明基于FTDR的两步标记发生在乙酰化蛋白质底物上，作者进行了组蛋白提取（图5A），并证实了在主要乙酰化底物组蛋白上的确存在TAMRA标记（图5B）。而存在HAT（组蛋白乙酰转移酶）抑制剂的对照组的TAMRA探针标记明显减少，表明该反应是具有乙酰转移酶依赖性的。为了测试基于FTDR的标记是否可以用于蛋白质底物的富集，作者在步骤2中用生物素-巯基探针处理细胞裂解物（图5A），并用蛋白质印迹分析证明乙酰化底物的存在，包括组蛋白和α-微管蛋白（图5C）。

图5  FTDR对乙酰化底物标记的验证

最后，作者提取了组蛋白和α-微管蛋白进行蛋白质组学研究（图6），并在它们的一系列赖氨酸位点上观察到了氟乙酰化，且几乎所有的这些位点与文献中报道的乙酰化位点具有很好的一致性，进一步证明这种标记策略可以以一般方式探测赖氨酸乙酰化。

图6  蛋白质组学分析验证已知蛋白质底物上的氟乙酰基标记位点

总结来说，本文开发了一种氟-硫醇置换反应（FTDR），可以用于乙酰化蛋白质底物的无位阻标记。基于FTDR的底物成像和检测显示了对乙酰转移酶底物进行全局分析的巨大潜力，对于理解乙酰化在生理和疾病中的作用具有重大意义。然而，这种FTDR反应比CuAAC等其他基于四嗪的生物正交反应更慢，未来的工作还将侧重于开发更具反应性的探针来改善和优化FTDR的反应条件。

【文献链接】

https://doi.org/10.1021/jacs.0c05605

【DOI号】
10.1021/jacs.0c05605

【参考文献】

[1]  Xiang, Z.; Ren, H.; Hu, Y. S.; Coin, I.; Wei, J.; Cang, H.; Wang, L. Adding an unnatural covalent bond to proteins through proximity-enhanced bioreactivity. Nat. Methods 2013, 10 (9), 885−888.

【本文作者】

王可凡

黄硕课题组硕士生