与大家分享一篇今年2月份发表于JACS上的工作，题目为“Spatiotemporal Activation of Protein O‑GlcNAcylation in Living Cells”，文章的通讯作者为国家蛋白质科学中心（北京）的秦伟捷研究员和浙江大学的易文教授。
O-GlcNAc是一种常见的蛋白质修饰，在细胞的生理和病理中发挥着重要的作用。细胞中O-GlcNAc水平主要受O-GlcNAc转移酶（OGT）和O-GlcNAc水解酶（OGA）调控，而蛋白质O-GlcNAc功能的研究由于缺乏控制相关酶活性的工具而受到限制。基于此，这篇工作报告了一种可在活细胞内调控OGT活性的策略，在OGT的关键催化位点K842引入光笼基团使酶暂时失活，再通过去除光笼分子来恢复酶活性（图1A,B）。首先，将K842对应的密码子突变为琥珀密码子TAG，通过基于吡咯赖氨酸的遗传密码扩展体系，合成了带有光笼（ONB）的OGT K842TAG（图1C）。免疫印迹实验表明，经过紫外辐射脱光笼后的OGT K842TAG使细胞内O-GlcNAc水平明显升高（图1D）。为了消除细胞内源OGT的影响，加入了OGT的抑制剂OSMI-4。如图1E所示，即使在OSMI-4存在的条件下，OGT K842TAG的激活也会使O-GlcNAc水平随着时间推移显著上调。接下来，研究人员富集了细胞裂解液中的O-GlcNAc修饰的蛋白质进行定量蛋白质组学分析。相同批次表达OGT K842TAG的细胞分别用紫外照射和不用紫外照射处理，富集后的O-GlcNAc蛋白用胰蛋白酶消化，然后将所得多肽进行质谱分析（图2A）。经过统计学检验，共获得了712个差异上调的O-GlcNAc蛋白，且不同的O-GlcNAc蛋白具有不同的糖基化速率（图2B,C）。作者进一步研究这个策略是否可以控制活细胞的行为。据报道，信号脂质鞘氨醇-1-磷酸(S1P)的存在会降低成纤维细胞内O-GlcNAc水平，诱导细胞快速形态收缩（图3A）。如预期所示，无UV照射时，S1P导致细胞明显收缩，而在UV照射下，细胞收缩在很大程度上被逆转(图3B)，表明OGT活性的光学恢复抑制了S1P诱导的细胞收缩。最后，研究人员尝试在亚细胞水平上进行OGT的空间激活。在细胞中，OGT存在于细胞质和细胞核中，其N端的四肽重复(TPR)单元和核内部定位信号(NLS)决定了OGT的核定位。为了仅实现OGT的胞质定位，研究人员对这两部分进行了突变，构建了一种新形式的sOGT K471TAG(图4A)，将其与OGT K842TAG同时在细胞中表达。如图4B所示，UV辐射下，OGT K842TAG显著增加细胞质和细胞核中的O-GlcNAc水平，而sOGT K471TAG仅特异性增加了细胞质O-GlcNAc水平，证明O-GlcNAc的亚细胞活化是可以实现的。总结来说，这篇工作开发了一种具有时空精度的光学控制策略来调控活细胞中OGT的活性。由于大多数糖基转移酶都含有一个关键的赖氨酸催化残基，这种时空激活策略还可以推广到各种糖基转移酶上，为蛋白质糖基化的研究提供了一个有价值的工具。
https://doi.org/10.1021/jacs.1c11041
王可凡
黄硕课题组硕士生
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