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本文作者：日本名古屋大学的Hiroyuki Asanuma和Hiromu Kashida教授
主要研究方向：光响应的功能核酸，人工核酸以及检测核酸的超灵敏探针开发
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研究背景
荧光成像是一种强大的技术，因为它揭示了细胞中蛋白质和核酸分子的空间信息。然而，荧光团的光谱重叠限制了可以同时识别的靶标数量为5个左右，这阻碍了对涉及许多生物分子的复杂生物学功能的理解。为了克服这一限制，已经开发了几种多重成像方法，包括多重振动成像和光谱成像。使用染料偶联抗体的免疫染色方法也使多种蛋白质同时成像成为可能。虽然这些新技术均能够实现多重成像，但所需的成像迭代次数与检测到的分子数量呈线性比例增加。沃森克里克碱基配对的DNA纳米结构的可编程性使各种标记成像技术的发展成为可能。使用DNA偶联抗体的DNA条形码技术已被用于通过重复杂交和去杂交方法以及使用DNA聚合酶与染料标记的核苷酸来实现空间多路蛋白检测。这些基于dna的方法需要许多不同序列的探针，复杂的操作和特殊的仪器，这限制了广泛采用。此外，使用DNA纳米技术用荧光条形码编码目标的多种鉴别方法也已被报道。将荧光染色核酸引入DNA折纸和3D DNA纳米棒的方法不仅可以通过荧光波长进行区分，还可以通过DNA纳米结构上的荧光强度或几何形状进行区分。然而，由于这些DNA纳米结构尺寸大，形成效率低，通常不能用于细胞内蛋白质成像。此外，DNA纳米结构可因与内源性DNA或RNA相互作用而被分解，并可被细胞内环境中存在的核酸酶消化。因此，尽管DNA技术非常强大，但为了实现一种多功能的多路标记方法，必须克服一些问题。
在这里，作者描述了一种依赖于简单线性核酸设计的多路标记方法的发展，我们称之为变色荧光条形码(CCFB)方法(图1a)。CCFB发射颜色是由核酸链通过立足点介导的链置换反应杂交确定的，并且通过CCFB的颜色序列可以区分多个分子(图1a)。例如，荧光颜色从红色到黄色再到绿色的CCFB与荧光颜色从黄色到红色再到绿色的CCFB是可区分的。这些颜色变化可以通过荧光显微镜来可视化(图1b)。可检测的生物分子可以呈指数增加，当有M种荧光分子被使用，荧光的变化就有N-1次，理论上MN种barcode可以被区分。此外，CCFB的结构非常简单，因此不需要大量的探针和复杂的序列设计。对于MXN的共价连接染料的核酸链，N-1种连接链，2N-3种互补链，因此共需要M*N+3N-4条链。CCFB的另一个优点是不需要清洗程序，因为荧光是由拴在互补低聚物上的淬灭剂淬灭的。因此，与其他多路杂交方法相比，CCFB成像更简单、更快，后者通常需要许多洗涤、杂交和去杂交操作。我们使用无环脱氧苏氨酸醇核酸D-aTNA作为CCFBs的组成部分(图1c)。D-aTNA可形成极其稳定的同双链，但不能与DNA或RNA形成稳定的杂化体。因此，避免了与细胞内DNA或RNA的意外杂交。此外，由无环核酸组成的荧光探针比DNA探针具有更高的猝灭效率和信号背景比(S/B)。在本文中，作者描述了CCFB的多路复用能力的验证，并演示了它在蛋白质检测中的应用。CCFB是一种多功能的标记平台，由于其简单和多路复用能力，将在化学和生物学中得到广泛应用。
图1. CCFB方法的原理图。
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结果与讨论
变色荧光条形码的设计。作者设计了一个CCFB系统，具有三个可区分的荧光基团，Cy3，Cy5和FAM，其发射荧光颜色改变两次（图2a）。CCFB的复合物由荧光团修饰的DNA链（F1,F3,F5）组成，在每一端都有荧光团和淬灭团，并用F2和F4相连。混合所有的F链将会形成一个稳定的双链。CCFB复合物的颜色会被Q1, Q2, Q3通过链置换反应逐步解码。每条Q链的加入都会产生一个完全互补的双链，其中原来F链上修饰的荧光团被淬灭，因此无需清洗步骤。且链置换的过程是几乎不可逆的，因为后续生成的双链更加稳定。最后释放出来的荧光颜色取决于F1，F3和F5上标记的荧光基团。由于相同的Q链可以解码多种荧光颜色的序列，因此CCFB标记系统不需要复杂的纳米结构设计和大量的寡核苷酸短链。
首先，作者研究了条形码复合物的颜色变化能力，其中，D-aTNA F链形成7-mer的的双链（图2a）。颜色变化从CY5—Cy3—FAM的变化（图2b），结果表明，连续的链置换反应会导致颜色像预期那样变化。
图2. CCFB的设计及实验验证。
接下来，研究了D-aTNA的长度对荧光的影响。还比较了D-aTNA条形码与DNA条形码的性能。构建了一个10 mer重叠DNA条形码复合物，该复合物以预定的顺序改变颜色。预期的荧光颜色变化与D-aTNA相似，表明DNA的CCFB也起作用。然而，从淬灭的荧光团中观察到强烈的背景信号。这与之前的结果相一致，即无环骨架比DNA更有效地猝灭。值得注意的是，10分子DNA复合物的Tm约为40℃，远低于7分子D-aTNA复合物。这些结果表明，使用D-aTNA可以构建具有很少背景发射的短条形码复合物。通过增加淬火剂的数量或使用更有效的淬火剂，如BHQ2，可以进一步提高淬火效率。因此，我们看中了D-aTNA的优势，在CCFB系统中采用了7-mer重叠D-aTNA设计，因为其有更高的淬灭效率，更双链形成更稳定且生物正交性好。
作者还研究了27个条形码集中其他ccfb的颜色变化。Cy3 Cy5 FAM序列配合物的数据如图2b所示。在所有情况下，加入Q链后，荧光颜色按照预定顺序发生变化。需要强调的是，生成这27个条形码只需要14个D-aTNA链，这证明了CCFB方法的效率。
体外多路CCFB成像。为了证明CCFB的多重成像能力，对附着在7-mer D-aTNA配合物上的聚苯乙烯珠进行了荧光显微镜成像。D-aTNA链与生物素部分结合，使其固定在链霉亲和素包被的珠子上(图3a)。将适当的F链加入株上，制备出Cy5—Cy3—FAM的条形码复合物。初始状态下，荧光成像仅显示Cy5发射。加入Q1导致Cy3的发射，加入Q3后导致FAM的发射（图3b和3c）。且不同的颜色变化都被观察到(图3d和3e)。以上三颜色变化的定量分析结果如图3f所示。但是可以很明显的看到，在磁珠上的淬灭效率低于溶液中。这种差异可能是由于静电相互作用和空间位阻效应导致的不完全杂交。总之，即使条形码被固定在固体上，也能有效地发生链置换反应。
图3. CCFB的体外成像能力验证。
接下来，为了验证CCFB方法的多路复用能力，作者评估了是否能同时识别9种编码的磁珠(图4a)。制备了一种用不同颜色序列编码的混合磁珠，每个磁珠都呈现出了不同的颜色变化（图4b）。由于所有的条形码都是由序列相同的链组成，因此可以从其他条形码的颜色变化判断该条形码完成了链交换而不变色。作者听过监测颜色的变化来解码条形码（图4c），并证明即使使用了三个荧光团，也可以明确地区分出所有9个条形码（图4d）。从上述结果，作者得出结论CCFB方法可用于多个目标物的同时检测。需要强调的是，本实验使用的是3个Q链，不需要进行洗涤操作。解码需要1.5小时。因此，与传统的多路荧光成像相比，CCFB系统能够以更简单的方式实现更快速的检测。
图4. 九种CCFB标记的磁珠验证多通道检测能力。
CCFB用于原位成像。接下来作者使用CCFB检测细胞中的蛋白。D-aTNA复合物首先与Phalloidin（一种与f-肌动蛋白结合的双环肽）结合。巯基修饰的D-aTNA通过异双功能交联剂琥珀酰亚胺。偶联到氨基修饰的phalloidin，产物被纯化。通过杂交合适的D-aTNA链，将序列为Cy5-Cy3-FAM的条形码连接到phalloidin上，然后将其与多甲醛固定的细胞孵育。30min后采集荧光，观察到很明显的Phalloidin和f-actin的结合（图5b）。随着Q链的加入，细胞中观察到明显的Cy5-Cy3-FAM的颜色变化(图5c)。上述结果表明，CCFB可用于细胞内蛋白成像。
图5. CCFB用于细胞内蛋白成像。
CCFB用于免疫染色。最后，作者还研究了CCFB在免疫染色中的应用（图6a和b）。采用类似于细胞蛋白成像的方法，将带有巯基修饰的D-aTNA低聚物偶联到抗小鼠的二抗上，并对二抗进行标记。通过PAGE确定共轭-条形码复合物形成。并将颜色变化为Cy5-Cy3-FAM的条形码通过D-aTNA链杂交到抗体上。为了验证CCFB系统你能够检测到该蛋白——高尔基体中Glogin-97。Q链的加入使得固定Hela细胞的荧光显微镜图显示从Cy5-Cy3-FAM的颜色变化（图6c）。类似地，另外两种蛋白XBP1和RPA32也同样被检测到，且观察到预期的荧光颜色变化（图6d和e）。这些结果证实了CCFB系统能够正确地检测目标蛋白。
最后，将CCFB系统用于同时检测三种蛋白，固定使用不同颜色变化的Glogin-97，XBP1和RPA32三种抗体，同时对Hela细胞进行免疫染色。通过加入Q链进行荧光成像（图6f）。在各个细胞器中观察到不同荧光颜色的变化（图6g）。且多通路的检测结果和单通路一致，表明多种蛋白可以被同时可视化，而不会被干扰。
图6. CCFB用于多蛋白的免疫染色。
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结论
在本研究中，作者描述了一种新的多重标记方法的发展和验证。CCFB系统比使用DNA纳米结构的荧光条形码标记方法更紧凑CCFB的这种简单性大大降低了染色核酸的合成成本。此外，该方法不需要特殊的仪器，也不需要复杂的操作，如清洗、强烈的荧光团失活。作者在CCFB系统中使用了D-aTNA，因为它能形成极其稳定的双链并减少背景干扰。此外，其核酸酶抗性和对天然核酸的正交性使该复合物即使在细胞内条件下也稳定。作者证明了CCFB方法可以用于多重蛋白质成像。使用CCFB进行免疫染色的方案不需要重复染色步骤，这是传统多重免疫染色的主要问题之一。此外，CCFB具有应用于标记蛋白质以外的生物分子的潜力。例如，当条形码复合物附着在核酸探针上时，它可以用于多路RNA标记。通过引入接近探针，例如用于空间接近检测的探针，CCFB方法可以应用于蛋白质、蛋白质和蛋白质RNA相互作用的成像。此外，CCFB设计的序列荧光变色能力也适用于其他基于DNA的技术，如DNA密码学，其中添加互补链可以解码荧光颜色序列加密的信息。综上所述，CCFB方法是一种多功能的标记工具，在生物学和纳米技术中具有实际应用价值。
原文链接：
https://doi.org/10.1021/jacs.1c09844
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