标   签：学科前沿

关键词：离子液体 生物偶联 叠氮化物

生物偶联技术已成为化学和生物学多方面领域的基石，其应用范围包括药物治疗、酶活性分析、细胞过程的阐明、荧光成像和材料制备等。生物分子标记工具设计的传统标准包括该方法与水介质的兼容性。目前，已有多种克服有机反应与水低兼容性的方法已被报道。然而，能用于兼容生物大分子与有机反应的新型介质研究明显不足。这种介质可以提供传统方法无法实现的生物大分子标记过程，因此开发这样的生物结合介质意义重大。

离子液体(IL)是一种熔点低于100 °C的盐，已作为有机溶剂的替代品得到了充分地研究。IL也可以作为生物分子的可替代介质，因为它的有机框架具有类似于生物缓冲剂的离子性质。近来，越来越多的研究表明各种生物大分子与IL的兼容性良好，在IL中比在水溶液中有更好的热稳定性。然而，IL迄今尚未应用于蛋白质生物偶联中。

基于以上考虑，美国北卡罗来纳州立大学的Jun Ohata等人报道了一项由IL和三苯基膦(PPh₃)促成的胺-叠氮化物偶联反应。利用生物大分子兼容的IL创建了一种新型生物结合策略，称为非水驱动反应溶剂中的生物结合(BINDRS)。

图1. IL中PPh₃催化的胺与叠氮化物的偶联反应

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

在IL中探索蛋白质标记方法过程中，研究者发现PPh₃可以诱导蛋白质胺基与烷基叠氮基发生偶联反应（图1A）。作为非质子型IL，基于吡咯烷鎓的IL 1-丁基-1-甲基吡咯烷鎓三氟甲磺酸盐(BMPyOTf)（图1B）具有良好的化学稳定性，因此被用于当前的研究，并且成功用于稳定蛋白质。

图2. 含氮底物上的四氮烯形成反应

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

研究者用各种含氮有机物作为底物进行四氮烯形成反应，观察到四氮烯形成反应对几种肽底物的烷基胺基团具有高反应效率的特异性（图2）。研究人员还证实了四氮烯的形成反应可以对蛋白质底物进行化学修饰，模型蛋白底物溶菌酶、α-糜蛋白酶原A和链霉亲和素均受到四氮烯形成反应条件的影响，且观察到了多重修饰（图3A）。蛋白质修饰的动力学分析表明，完成反应所需的时间不到1小时（图3B）。修饰反应对蛋白质底物的适用性也通过凝胶荧光分析得到证实（图3C）。

图3. 活性保持的蛋白质上的四氮烯形成反应

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

此外，尽管存在三个连续的氮-氮键，但四氮烯键却是生物稳定的。为了评估修饰键的稳定性，研究者使用生物素叠氮化物生产生物素化的α糜蛋白酶原A，在生物素化的蛋白质暴露于各种条件下后，通过抗生素蛋白印迹观察到超过80%的生物素的存在，这表明修饰的键依然保留在蛋白质上（图3D）。

图4. 抗体上形成四氮烯的生物偶联

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

研究者将目光转向了具有更高分子量和更复杂结构基序抗体的修饰。用叠氮生物素对赫赛汀（一种抗体）进行修饰（图4A），赋予了抗体亲和素的特性。尽管磷化物是通过还原二硫键使抗体碎裂的典型试剂，但基于叠氮和三苯基膦的修饰条件并没有造成抗体的明显碎裂（图4B），这进一步证明了该反应与蛋白质的兼容性。

最后，研究者通过四氮烯修饰反应测试了抗体-药物结合物(ADC)的制备，使用SK-BR-3乳腺癌细胞通过共聚焦显微镜测试赫赛汀-SN- 38缀合物的抗原识别能力（图4C）。观察到未偶联的赫赛汀和赫赛汀-SN- 38偶联物的免疫荧光信号产生几乎相同的荧光信号强度。

综上，该工作报道了由IL促成的蛋白质上胺-叠氮化物偶联反应，即四氮烯形成反应。这是一种高效和高选择性的生物结合策略，为非传统介质中有机化学反应的发展提供了新的思路。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c06092

原文作者：

Hisham M. El-Shaffffey, Elizabeth J. Gross, Yvonne D. Hall, and Jun Ohata

DOI: 10.1021/jacs.1c06092