许多蛋白质偶联的策略都是利用亲电试剂来捕获如Cys、Lys一类的亲核氨基酸，或是利用氧化还原策略修饰Met以及自由基反应修饰Trp等。而除了利用天然氨基酸侧链固有反应活性或是费力地引入非自然功能活性外，还有一种方法则是将亲核氨基酸残基转化为亲电基团（图1A）。

近期柏林洪堡大学的Christian P. R. Hackenberger教授团队在Journal of the American Chemical Society上发表了一篇工作，题为Chemically Induced Vinylphosphonothiolate Electrophiles for Thiol–Thiol Bioconjugations。在该文章中，他们开发了一种新的将Cys侧链的硫醇转化为亲电把手的方法，即将亲核硫醇转化为具有硫醇选择性的亲电乙烯基硫代磷酸脂。其中参加反应的序列会使乙烯基硫代磷酸脂直接安装在肽和Cys侧链上。然后他们利用该方案实现了高产率的单克隆抗体曲妥珠的半胱氨酸修饰，同时也进一步实现了双泛素以及泛素-α-突触核蛋白缀合物的构建。

将亲核氨基酸的侧链残基转化为亲电基团的策略，最为常用的亲电试剂是Ellmann’s试剂，从而形成由二硫键连接的蛋白-蛋白偶联物，但由于该方法在还原环境中二硫键不稳定而受到限制；另一种方法则是将Cys首先转化为Dha（脱氢丙氨酸），再进一步和巯基反应或是自由基反应偶联，但是产生Dha后的偶联会形成异构体，且目前对该方法应用于无相互作用蛋白的偶联还没有相关报道。

在前期工作中，作者发现了一种亲电磷试剂，磷酸酰胺可与叠氮发生偶联反应生成乙烯基或是炔基磷酸酯，该反应可在蛋白质上引入亲电试剂从而可后续与巯基进行偶联（图1C）。基于此，他们将原实验中的乙烯基磷酸酯变成了乙烯基硫代磷酸脂，并进行了后续的工作（图1B）。

图 1

首先，他们开发了一条通过亲电二硫化物从硫醇前体中获得乙烯基硫代磷酸脂的合成路线。为优化该反应，作者采用乙基衍生物1作为模型底物，并用31P-NMR进行表征（图2A）。可以看出副产物13和所需产物6的比例为1：1，且产物13的原位形成说明乙烯基硫代磷酸脂对巯基具有反应性（图2B）。作者推断，若离去基团被质子化不进行亲核反应，那么就可避免副产物的形成了。因此，该团队向其中投入10当量TFA，结果表明副产物的形成的确被抑制（图2C）。且由于在DMSO中，反应物会有部分发生氧化反应，因此需要1.5-2当量才能完全转化完毕。

图 2

接下来，他们采用优化后的反应条件（2当量DMSO，10当量TFA），从亲电二硫代化合物1-4合成产率较高的相对应的乙烯基硫代磷酸酯的衍生物6-9（图3A）。此外，他们还根据序列将乙烯基硫代磷酸脂部分连接在模型肽KYRCXK的Cys残基上，X是不同的氨基酸，10a-10e的分离收率为29-41%，说明乙烯基硫代磷酸脂可选择性的连接在未保护的Cys侧链上可，且后续可以通过改变氨基酸X来测定反应的选择性。

图 3

随后，该团队研究了乙烯基硫代磷酸脂对硫醇的反应性能，因目标是合成蛋白-蛋白偶联物，因此他们主要关注于对硫醇加成的动力学和选择性，以及乙烯基硫代磷酸脂在硫醇加成前后的稳定性。

第1个模型反应中，该团队采用苄基衍生物7，反应条件如图4所示。实验结果显示，14作为单一产物且具有77%的收率（HPLC）。接着，他们将纯化的10a-10e与还原型谷胱甘肽反应，结果显示其并没有副产物；然后他们采用荧光高效液相色谱研究了巯基衍生物加入的反应动力学，推导出二阶速率常数为0.0021M^-1s^-1（pH=7.4），0.0074 M^-1s^-1 (pH=8.5)；最后，他们对乙烯基硫代磷酸脂对酸碱以及温度的稳定性进行了研究，表现出其在酸性条件下的极佳稳定性。

图 4

接着，该团队探讨了乙烯基硫代磷酸脂在蛋白质上标记Cys残基的适用性，尤其是抗体上。他们选取了生物素衍生物8以及对治疗相关的单克隆IgG抗体曲妥珠单抗进行反应（图5A）。在没有二硫化物DTT还原的对照实验中，未观察到抗体标记，因此显示出乙烯基硫代磷酸脂具有优良的半胱氨酸选择性（图5B）。

图 5

最后，该团队采用该方案诱导了两个蛋白质间的偶联，并主要着重于蛋白质-泛素偶联。泛素化是蛋白质翻译后最大的可逆修饰之一，调节从蛋白质降解和运输到DNA修复和转录的各种细胞过程。而研究不同泛素链的生物学功能以及探究泛素化对底物蛋白的影响是当前研究的主要挑战。因此作者想通过应用乙烯基硫代磷酸脂偶联策略来生成不可水解的均质泛素-蛋白质偶联物，且最终实现了双泛素和泛素-α-突触核蛋白缀合物的构建（图6）。

图 6

本文提出了一种用于蛋白质标记以及蛋白质间的偶联的Cys反应试剂——乙烯基硫代磷酸脂，并对其反应条件进行了优化，且实验结果显示出其优异的半胱氨酸选择性以及酸稳定性。而基于该试剂的偶联策略则能够以化学选择性和位点选择性的方式使两个含有游离半胱氨酸的生物分子偶联，最终可用于生成仅含规范氨基酸的均质肽和蛋白质偶联物，特别是不可水解的蛋白质-泛素偶联物。

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