摘要

图1.图片摘要

背景介绍

O-连接的α-N-乙酰半乳糖胺(O-GalNAc)的糖基化曾经被称为粘蛋白型O -糖基化，是高等真核生物中最丰富的翻译后修饰形式之一，对正常胚胎发育、免疫细胞功能和代谢稳态至关重要。O-GalNAc糖基化异常与肿瘤进展相关。因此，启动O-GalNAc糖基化的多肽N-乙酰半乳糖酰基转移酶(GalNAc-Ts)受到不同程度的调控，其表达与各种疾病状态相关。人类基因组编码20个GalNAc-T序列，构成了最大的、可以说是最复杂的糖基转移酶家族之一。GalNAc-Ts是膜相关的II型高尔基驻留酶，高尔基腔内有着邻近的催化和凝集素结构域。一些同工酶似乎具有相同的功能冗余，这反映在微妙的动物敲除表型上。而另一些则是生存能力或特定器官功能所必不可少的。

尽管GalNAc-Ts参与了人类生物学的许多方面，但我们对GalNAc-T底物选择的了解是有限的。据推测，在细胞核中，GalNAc-Ts将GalNAc残基从核苷酸糖供体尿苷二磷酸N-乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAc)转移到分泌途径中蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和可能的Tyr残基的羟基上。GalNAc-T包含一个N端催化结构域和一个C端凝集结构域，这两个结构域之间的相互作用决定了不同GalNAc-T同工酶的受体底物特异性。

偏好肽的GalNAc- ts利用凝集素结构域将新的GalNAc残基安装在糖肽上现有的GalNAc残基上(N或C端方向有6-17个残基)。除了凝集素结构域对GalNAc的远距离识别外，由于催化结构域上额外的GalNAc结合位点，糖肽偏好的GalNAc-Ts可以在糖肽上的GalNAc残基附近安装一个GalNAc。

由于调控糖位点特异性的机制复杂，单个GalNAc-T修饰的蛋白底物和特定的糖基化位点尚未得到很好的报道，阻碍了我们对其生物学功能和疾病因果关系的探究。由于蛋白质底物冗余和重叠的蛋白质靶位点的存在，使用经典的遗传学方法理解GalNAc-T功能蛋白质底物是复杂化的。更多的靶向遗传学研究证实了ApoCIII和ANGPTL3的GalNAc-T2糖基化在高密度脂蛋白代谢中的作用，FGF23的GalNAc-T3糖基化在家族性肿瘤钙化症中的作用，Notch的GalNAc-T11糖基化在异质性中与先天性心脏病相关。尽管有这些尝试，关于特定的GalNAc-T的特定氨基酸偏好的主要信息来源仍然是肽底物的体外测定的表现。

Clausen和同事在识别GalNAc-T底物特异性方面取得了重大突破，使用工程细胞系来生成显示截断聚糖的O-GalNAc糖蛋白。然而，考虑到各种GalNAc-T的相互依赖性和底物冗余性，这种方法中使用的单一GalNAc-T的缺失很可能不能提供该家族中单个酶的作用的完整图像。

作者设想了一种互补的方法，在这种方法中，GalNAc-T同工酶被设计能够接受化学标记特定蛋白质底物和糖基位点的底物模拟物。这种“bump-hole”工程策略的关键是识别可以突变改变活性位点的关键残基，使其适应修饰过的底物。关键是，这种“bumped”的底物不应该被酶家族的原生成员识别，从而去除其他内源性GalNAc-Tt同工酶产生的假阳性信号。

以往的研究表明，由于糖基转移酶活性位点被修饰以接受非天然底物，具有酶-底物工程的适应性。特别相关的是，酶β-1,4-半乳糖转移酶和O-β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶已被合理设计以适应核苷酸糖的化学处理。这两种工程糖基转移酶都表现出了扩展的底物特异性。这些工程酶-底物对已成功地用于研究O-GlcNAc修饰的蛋白质。在糖基转移酶家族中应用正交凸孔工程有可能对关键生物学产生新的见解。

作者观察到GalNAc的甲基从一个由受体肽和凝集素结构域形成的口袋中延伸出来，进入一个巨大的溶剂暴露的裂口。这种晶体结构表明，N-酰基修饰的GalNAc类似物可能不会在GalNAc- ts的凝集域发生空间冲突，其结合模式与GalNAc-多肽类似。

作者生成了四个单点突变体(I253A, L310A, F361A和F361S)和一个双突变体(I253A/L310A)，该突变体为可溶的FLAG表位标记的GalNAc-T2结构，包含催化和凝集素结构域，从哺乳动物细胞中分泌。初步筛选纯化的蛋白质和已知肽底物EA2 -生物素显示，F361突变体带有UDP-GalNAc或UDP-GalNAz的活性极小，与随后发表的诱变数据一致。

有了纯化酶、合成肽底物和UDP-GalNAc类似物，作者使用基于高效液相色谱的酶学检测以组合方式评估了GalNAc-T凸孔工程的可行性。

作者还研究了GalNAc侧链的增大如何改变野生型和双突变酶的底物活性。对于类似物11-14，我们观察到，随着含炔凸起的大小增加，野生型酶的活性急剧下降。相比之下，双突变酶与这些较大的烷酸保持了活性。在(R)-14的极端情况下，野生型酶无法检测到糖肽的形成，而双突变酶仍能产生糖肽产物。

表1.野生型和工程型GalNAc-T2和udp -糖对的动力学参数

图6.GalNAc-T2酶-底物正交配对的筛选

为了在生物系统中实现潜在的应用，野生型GalNAc-T必须不接受UDP-GalNAc存在时碰撞的UDP-GalNAc类似物。作者检测了野生型GalNAc-T2对UDP-GalNAc的相对选择性，并与选定的类似物进行比较。竞争实验表明，在UDP-GalNAc和UDP-GalNAc模拟物(S)-3、7、11或13的1:1混合物存在时，野生型GalNAc- t2确实优先将GalNAc转移到肽-1。在包括模拟物13的反应中，观察到的糖肽产物几乎全部来自UDP-GalNAc。

图7.相对于UDP-GalNAc类似物，野生型GalNAc-T2对UDP-GalNAc的选择性

令人欣慰的是，为GalNAc-T2开发的bump–hole方法可以直接转移到两种GalNAc-T同工酶上，尽管它们对底物的偏好不同。野生型GalNAc-T1有效地催化了UDP-GalNAc的糖基化，而UDP-GalNAc模拟物13的糖基化活性很低。

最后，作者探索了所有三种GalNAc-T凸孔对的糖基化位点特异性是否因引入的活性位点突变而改变。由于MUC5AC-3和/或-13上潜在的苏氨酸受体位点位于现有GalNAc残基的1到11个残基之间，这些糖肽使我们能够评估催化结构域和凝集素结构域对糖位点测定的影响。野生型和双突变型GalNAc-T2对MUC5AC-3和MUC5AC-13的糖基化模式显示，在N端和c端方向，凝集素域辅助糖基化活性的糖位点特异性相似。

实验表明T10(I266A/L321A)与MUC5AC-3保持了糖肽偏好同工酶的特性，我们预计这一结果将扩展到其他底物。

综上所述，这些数据表明GalNAc-T凸孔对在检测的受体底物中保留了固有酶-底物对的糖基化位点特异性和一般动力学参数。这样的结果对于应用该技术在生物系统中发现新的蛋白质底物和糖基化位点很有希望。

这项工作代表了糖基转移酶家族的一个稳健的正交bump-hole系统，其中工程酶仅使用合成的模拟底物而不接受天然底物。值得注意的是，修饰后的底物不能被原生GalNAc-T同工酶利用。虽然结构数据是这项研究的基石，但合成和快速筛选许多衬底类似物的能力对识别正交凸孔对至关重要。通过探索N-酰基位置周围的化学空间，为双突变体GalNAc-Ts识别出了具有精确特异性的底物。

作者设想，像这里描述的凸孔对可以普遍适用于GalNAc-T家族，因为它们具有良好的UDP-GalNAc结合位点。在这里开发的bump-hole酶-底物对为在生命系统中识别GalNAc-Ts的生物底物的新方法奠定了基础，类似于对其他酶家族所做的工作。

作者：LZH

审核：ZZX

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.9b04695