中国上海科技大学刘伟民教授、黄逸凡教授和季泉江教授课题组联合美国俄勒冈州立大学化学系方翀教授课题组利用飞秒时间分辨振动态和电子态光谱技术针对具有大斯托克斯位移的红色荧光蛋白mKeima进行了超快结构动力学的研究，解析了mKeima在液相完整的光反应动力学循环过程。

mKeima荧光蛋白是具有大斯托克斯位移（Large Stokes shift, LSS）荧光发射的红色荧光蛋白（吸收峰位于440 nm，荧光发射峰位于620 nm）。其中激发态质子传递是mKeima蛋白产生LSS荧光发射的重要原因。X-射线晶体结构学解析表明mKeima蛋白可能存在顺式（cis）和反式（trans）两种构象的发色团分子，但在中性（pH=7）条件下是否同时存在未知，而且目前发色团产生LSS荧光发射的物理机制尚不清楚。一个核心问题在于：是否cis和trans两种构象的发色团分子都对LSS荧光发射有贡献？本项目联合研究团队首次采用波长可调的飞秒受激拉曼（振动态）光谱技术（特别发展了基于对比样品的全谱整体分析）和多种飞秒时间分辨激发态（电子态）光谱技术，进一步结合相关发色团系统性的量子化学计算，在生理相关环境中全面解析了mKeima蛋白完整的与质子传递和异构化有关的光反应循环过程（图一）。

实验结果显示mKeima蛋白中的trans发色团是产生620 nm处LSS荧光的主要来源；而cis发色团由于激发态超快（约120皮秒时间常数）异构化的影响只在520 nm处产生极弱的荧光发射。通过荧光蛋白在水/重水同位素效应以及不同pH环境下的动力学分析，联合研究团队获取了mKeima清晰的光循环过程，如图一所示，其中包括发生在发色团cis和trans两种构象下的激发态质子传递（cis-A*态到cis-I*态、trans-A*态到trans-I*态），顺-反异构化过程（cis-I*态到trans-I态），以及基态质子传递过程（cis-I态到cis-A态，trans-I态到trans-A态）。荧光蛋白在液相中的异质性（heterogeneity）也在推导出发色团激发态到基态的时间常数关联中有了生动体现。这项工作清晰展示了飞秒受激拉曼光谱技术结合各种时间分辨电子光谱技术和量子化学计算所发挥出的强大能力，自数据到机理融会贯通，从而提供了一种可以在生物光敏蛋白及其衍生探针的生理条件（譬如水溶液环境）下研究复杂体系激发态结构动力学（分子电影）的有效手段。