细胞外核苷酸（主要是 ATP，但也有 ADP、UTP、UDP、UDP-sugars）和核苷（腺苷）作为信号分子参与广泛的生理和病理过程，如细胞生长、伤口反应、组织损伤、炎症和移植免疫。尽管 ATP 信号在各种细胞过程中具有重要的意义，然而由于可用的 ATP 检测方法的局限性，仍然缺乏对 ATP 动力学时间和空间分量的精确测量。

大连理工大学刘猛教授课题组和加拿大麦克马斯特大学李应福教授课题组在《Journal of the American Chemical Society》上发表了题为“Rapid and Specific Imaging of Extracellular Signaling Molecule Adenosine Triphosphate with a Self-Phosphorylating DNAzyme”的研究论文。该团队设计了一种锚定在细胞表面上的自磷酸化DNAzyme（表示为SPDz）传感器，能够对细胞外ATP的瞬间变化进行荧光成像。SPDz传感器表现出亚秒级响应动力学、极高的特异性和微摩尔亲和力。特别地，细胞表面锚定的SPDz传感器能够用于星形胶质细胞中应激诱导的内源性ATP释放和单细胞水平的机械刺激诱导的ATP释放的荧光成像。本文还利用SPDz传感器在电刺激星形胶质细胞中观察ATP信号的快速动态特性。因此，SPDz传感器是用于监测不同细胞过程中ATP信号的强大工具。

图2 （a）细胞表面锚定的FDK1传感器用于细胞外ATP荧光成像的示意图。在 3'端用胆固醇修饰了荧光标记的DK1（FDK1）以便FDK1可以锚定在质膜上。在存在 ATP 的情况下，FDK1在自磷酸化反应缓冲液（SPB）中会将磷酸基团从 ATP 转移到其5'末端。由于其高碱性，通过快速更换lambda核酸外切酶（λ-exo）反应缓冲液（LEB，pH 9.4）来终止磷酸化反应。由于LEB还包含λ-exo和一个与FDK1部分互补的淬灭剂标记的DNA寡核苷酸（QDO），预计会发生两个事件：（1）FDK1与QDO结合（QDO:FDK1的摩尔比为10:1），使荧光团（F）和猝灭剂（Q）靠近以达到最大的荧光猝灭；（2）λ-exo催化从 5'-磷酸化的FDK1-QDO双链体中去除5'-单核苷酸，生成特定长度的单链FDK1片段（FDK1F），从而由于QDO的解离产生强烈的荧光信号。（b）在λ-exo存在和不存在的情况下，FDK1和QDO消化反应产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（dPAGE）分析。结果显示65%的FDK1在磷酸化和消化反应后的10分钟内被消化（泳道4），相比之下，当SPB中不存在ATP时，仅只有5%的FDK1被消化（第2道）。（c）在加入λ-exo后，在QDO存在下对FDK1的消化进行实时荧光监测。随着ATP浓度升高到3-500 μM之间，其信号强度逐渐增加。在10分钟内获得了大约8倍的最大信号强度。使用这种方法可以检测低至3 μM的ATP。

图3 （a）FDK1锚定的MCF-7细胞在指定条件下自磷酸化（5分钟）和消化反应（10分钟）后的共聚焦荧光图像。结果显示进行自磷酸化和消化反应会在质膜上产生强烈的荧光信号。相比之下，未孵育 ATP 的细胞在相同条件下显示的信号最小。（b）FDK1锚定的MCF-7细胞与ATP、ADP、AMP、UTP、GTP、CTP、UDP、dATP、dGTP、dCTP或dTTP孵育的流式细胞术测定。SPDz传感器特异性响应 ATP，不响应ADP、AMP、UTP、GTP、CTP、UDP、dATP、dGTP、dCTP和dTTP，与使用DK1获得的结果一致（图1c)。

图4  用含（a）或不含（b）谷氨酸（2 mM）的缓冲液灌注后FDK1锚定星形胶质细胞的共聚焦荧光图像。与未经处理的星形胶质细胞相比，经谷氨酸处理的星形胶质细胞的荧光增强。（c）响应谷氨酸刺激的突变MFDK1锚定星形胶质细胞的共聚焦荧光图像。突变的SPDz MFDK1锚定星形胶质细胞在谷氨酸刺激下未观察到荧光信号。（d）响应于不同浓度谷氨酸的剂量依赖性S/B值。增加刺激物谷氨酸的浓度会导致逐渐增强的反应，产生剂量依赖性S/B增加。（e）在星形胶质细胞上施加30秒的流体剪切应力（2 Pa）的示意图。具有（f）或不具有（g）剪切应力刺激的FDK1锚定星形胶质细胞的共聚焦荧光图像。（h）MFDK1 锚定星形胶质细胞暴露于剪切应力后的共聚焦荧光图像。结果显示施加剪切应力后，在星形胶质细胞的许多区域中观察到荧光信号，但在未处理的星形胶质细胞或MFDK1锚定的星形胶质细胞中未观察到荧光信号。总之，这些结果表明SPDz传感器具有足够的灵敏度、动力学和特异性来监测星形胶质细胞的ATP释放。

图5  SPDz传感器以单细胞分辨率响应ATP的释放。（a）用玻璃微电极进行机械刺激星形胶质细胞的图像。（b）FDK1锚定星形胶质细胞对局部机械刺激的荧光图像。（c）ROI中的相对荧光强度(%)与具有最大荧光响应的ROI的距离图。机械刺激诱发的荧光响应在星形胶质细胞的亚细胞区域具有高度异质性。如图 5b 所示，在几个感兴趣的亚细胞区域（ROI，2.8 μm × 2.8 μm）观察到最大的荧光响应。

图6 （a）电刺激示意图，其中微电极位于FDK1锚定星形胶质细胞附近以引起ATP释放。为了研究内源性释放的 ATP 对附近细胞活动的影响，用（b）10 pA、（c）40 pA和（d）100 pA去极化电流脉冲(500 ms)处理的FDK1锚定星形胶质细胞中荧光图像。系统地改变电流强度表明低电流刺激（10 pA）不会引起荧光响应，中等电流刺激（40 pA）触发高度局部化的ATP释放，而高电流刺激（100 pA）在许多区域引发强的荧光响应。综上所述，这些数据表明SPDz传感器可以有效监测电刺激后的细胞外ATP信号。

总之，本文设计了一种SPDz传感器，用于监测具有高时间分辨率和高配体特异性的细胞外ATP的变化。SPDz传感器相对于其他基于荧光的ATP传感器有三个特性，包括亚秒响应动力学，对ATP的极高特异性，以及对ATP的微摩尔亲和力，这些特性对于作为信号分子分析细胞外ATP非常理想。目前，该团队还在通过将DNAzyme转化为DNA适配体来设计具有实时成像功能的SPDz传感器。这将在不催化化学反应的情况下结合靶标产生信号。因此，本文所描述的策略可以进一步扩展到其他传感器，用于监测参与多种细胞过程的各种已知的细胞外核苷酸。

https://doi.org/10.1021/jacs.1c04925

刘猛，大连理工大学环境学院教授，博士生导师，副院长。2012年毕业于大连理工大学，获工学博士学位；2013-2016年加拿大McMaster大学生物化学与生物医学系博士后；2016-2017年McMaster大学生物界面研究所博士后。辽宁省化工学会医药化工专业委员会委员，获首届中国生物技术创新大会“最具发展潜力奖”、“2019年度Analytical Methods Emerging Investigator ”。先后主持和承担了国家海外高层次人才引进计划-青年项目，国家自然科学基金面上项目和优秀青年科学基金项目，国家重点研发计划食品安全关键技术研发专项子课题，固废资源化专项课题、辽宁省兴辽英才计划青年拔尖人才项目等。研究方向包括功能核酸、生物传感和微流控器件，相关研究成果发表在Accounts of Chemical Research, Nature Communications, Angewandte Chemie International Edition, ACS Nano等期刊，授权美国专利2项。

编辑：王苗

审核：谢诗仪

推送：陈慧芳