给大家介绍一篇最近发表于 JACS的工作，题目为“Site-Selective Functionalization of Methionine Residues via Photoredox Catalysis”。通讯作者为美国国家科学院院士，普林斯顿大学默克催化中心的David MacMillan教授。 MacMillan研究组在不对称有机催化领域有突出贡献，开发了许多催化新概念，例如有机催化、级联催化、协同催化和光氧化还原催化等，形成了独特的方法论并应用到一系列复杂天然产物和药物的全合成中。

蛋白质选择性修饰的一般策略的发展仍然是化学生物学中的重要挑战。传统的生物缀合方法依赖于亲核氨基酸残基和小分子亲电子试剂之间的取代反应，主要集中在赖氨酸和半胱氨酸等高度亲核残基上。然而，在基于亲核性的反应性范式下，难以控制修饰的蛋白质混合物的结构均质性：赖氨酸残基的表面丰度使位点选择性生物缀合具有挑战性，而基于半胱氨酸的修饰则需要对天然蛋白质进行预处理，以减少无法获得游离半胱氨酸残基的二硫键（图1左图）。面对这些挑战，近年来该领域的研究多集中在对其他丰度低但亲核性弱的氨基酸残基的修饰上，寻找替代亲核性反应的新方法。

MacMillan研究组独创了利用天然氨基酸残基固有还原电位的差异来实现位点选择性的新型修饰方法，并已成功应用于蛋白质C末端天冬氨酸和谷氨酸残基的烷基化。具体来讲，他们基于光氧化还原的策略，将可见光的光子能量用光催化剂收集并作为电化学势传递。由氨基酸氧化电位控制的单电子转移（SET）事件可以选择性地靶向特定残基以产生反应性的“开壳”自由基中间体，而其他残基则保持完整。在这篇文章中，作者进一步开发了针对具有明显的疏水性和很弱的亲核性的甲硫氨酸进行选择性修饰的新型偶联技术（图1右图），使用光还原的策略，通过激发的光催化剂实现硫的单电子氧化，随后进行α-去质子化以生成以碳为中心的α-硫代自由基。该亲核自由基即可与烷基化试剂进行迈克尔加成完成修饰。

图1. 通过光氧化还原催化开发的甲硫氨酸选择性生物共轭方法

首先，作者以含甲硫氨酸的四肽(VMFP)为模型，探究了合适的光催化剂类型。理想的光催化剂需要高效完成硫的单电子氧化和α位去质子化，保证α-硫代自由基的生成，且不会产生甲硫氨酸的氧化副产物亚砜。尝试了铱基和钌基络合物等光催化剂后，作者发现黄素类催化剂具有最好的效果。光黄素(Lumiflavin)催化甲硫氨酸的机制如图2所示。可见光(440nm)激发光黄素(LF, 3)产生长寿命的三重态(³LF, 6)，这种高度氧化的激发态能与甲硫氨酸的硫醚(5)发生电子-质子转移(ET-PT)，分别转化为甲硫氨酸自由基阳离子(7)和光黄素自由基阴离子(8)；二者进一步反应，(7)的α位去质子化转变为α硫自由基(9)，此时(8)转变为稳定的还原态光黄素(10)；接下来，(9)即可与迈克尔受体分子(2)加成，生成α-酰基自由基(11)，并与(10)发生氢原子转移(HAT)，生成最终加成产物(12)，而(10)也再生为基态的光黄素(3)，至此完成了一个催化循环。虽然蛋白质中酪氨酸、色氨酸、组氨酸也可与激发态光黄素进行ET-PT，但产生的自由基中间体是亲电子的无法进行迈克尔加成，因此该方法是具有氨基酸选择性的，目前的干扰只有未成二硫键的半胱氨酸一种。

图2. 光黄素催化甲硫氨酸烷基化的最佳条件和机理展示

第二步，作者将注意力转向了研究迈克尔受体的范围（图3）。在这部分中，选择抑肽酶作为模型蛋白底物。结果表明该方法适用的迈克尔受体范围很广烷基化转化效率很高。进一步以乙烯基砜(14)为基础，作者实现了将各种官能团和生物有效负载掺入蛋白质中。其中，即使羧酸和伯胺部分(15, 16)也同样具有良好的耐受性；含有生物正交叠氮化物和炔烃手柄的基团 (17, 18)也很容易被引入并进一步用于铜催化的点击化学反应。因此，光催化缀合可以在迈克尔受体组分上添加一系列官能团，从而允许引入与传统的基于亲核性的生物缀合方案不兼容却有用的功能柄。

图3. 迈克尔受体范围

第三步，作者将此方法应用于多种蛋白质底物，探究了该方法的通用性和位点选择性。结果表明，结合效率和甲硫氨酸的暴露程度和反应时间相关，一些位阻较大的甲硫氨酸需要延长反应时间才能有效修饰。最后，作者将此方法应用于生物系统中，测试标记甲硫氨酸是否影响蛋白质的结构和二级的功能化。如图4所示，选择增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为模型，它的结构发生微小改变会显著影响发射荧光的性质。作者用含炔基的受体(17)作为迈克尔受体，希望将光还原方法和铜点击反应(CuAAC)联用实现多种功能化。结果表明，叠氮修饰的生物素分子(27)和聚精氨酸(28)都可以用此方法修饰到EGFP的甲硫氨酸上，且不影响其荧光。进一步用修饰有聚精氨酸的EGFP处理SJSA-1细胞，则聚精氨酸可以引导EGFP被内吞转运到细胞中。证明光还原的甲硫氨酸选择性修饰能够高效快速的对蛋白质进行功能化。

图4. 通过光氧化还原甲硫氨酸修饰方案对EGFP进行功能化

总结来说，作者开发了一种全新的甲硫氨酸选择性功能化的方法，与此前Chang和Toste小组^[1] 、Gaunt小组^[2] 所开发的使用选择性硫氧化试剂将硫醚转化成亚硫亚胺等方法不同，本文作者使用光氧化还原催化的方法，该方法温和且具有高度选择性和出色的生物相容性，是一种极具应用潜力的生物缀合技术。这种方法的开发是化学生物学领域的一个重要的进步。

【本文作者】

刘瑶

黄硕课题组博士生