JACS｜氨基硫醇特异的生物正交新方法用于蛋白质/多肽定点修饰

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为大家介绍一篇 2020 年发表在J. Am. Chem. Soc.的文章，题目为 “Condensation of 2‑((Alkylthio)(aryl)methylene)malononitrile with 1,2-Aminothiol as a Novel Bioorthogonal Reaction for Site-Specific Protein Modification and Peptide Cyclization” 。针对多肽和蛋白质上的氨基硫醇功能团，本文设计了一种能够与之发生生物正交反应的TAMM (2-((alkylthio)(aryl)methylene)malononitrile) 分子，实现蛋白质的定点修饰、多肽的环化以及小分子介导的环肽噬菌体展示等。通讯作者是来自厦门大学的吴川六教授（http://chlwu.xmu.edu.cn）和英国卡迪夫大学的蔡羽轩老师（https://tsai-lab.org）。吴川六课题组的主要研究方向为多肽分子探针、荧光探针、多肽/蛋白递送系统、蛋白质–多肽相互作用等。蔡羽轩课题组的研究兴趣为生物学研究的化学工具开发，包括生物分子的合成，胞内小分子功能研究以及非天然氨基酸研究等。

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【背景】

定点修饰是研究肽和蛋白质的结构与功能强有力的手段。然而，目前的蛋白定点修饰技术存在着反应效率低、试剂昂贵、生物相容性差等方面的缺陷。1，2-氨基硫醇是一种活性较强的双亲核试剂，天然存在于N端的半胱氨酸残基中。由于其分子小、原子利用率高、对蛋白质/多肽的结构干扰小等优势，已被应用于蛋白质标记、多肽环化等相关领域。然而，现有的标记方式使用芳香性的硼酸类似物与1，2-氨基硫酸反应，此类分子易受胞内的过氧化物酶影响而失去活性，使其应用受限。

为了解决上述问题，本文作者提出了一种全新的、与氨基硫醇反应的小分子化合物(2-((alkylthio)(aryl)methylene)malononitrile)，即TAMM。TAMM与蛋白质/多肽的氨基硫醇基团发生缩合反应，形成TAMM-peptide/protein共价复合物，温和、稳定地实现多肽与蛋白的定点功能化。作者实现了TAMM对遗传编码的蛋白定点标记以及TAMM介导的多肽环化等应用；还将TAMM与噬菌体展示相结合，在噬菌体上构建了依赖TAMM环化的多肽文库，以此文库进行生物淘选，获得了针对不同靶标的高亲和力环肽，证实了该反应在化学和合成生物学研究领域中的潜力。

【设计思路】
2-（（烷硫基）（芳基）亚甲基）丙二腈（TAMM）与1,2-氨基硫醇缩合的反应如下图1。在TAMM缩合反应中，乙烯基硫化物基团被1,2-氨基硫醇的硫醇基团取代，其上的氨基发生迈克尔加成反应生成噻唑烷，脱去丙二腈生成2-芳基-4,5-二氢噻唑（ADT）。TAMM和ADT分子无毒性，反应可在碱性或者磷酸环境中发生，是生物相容性好的正交反应。

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图1 2-（（烷硫基）（芳基）亚甲基）丙二腈（TAMM）与1,2-氨基硫醇缩合反应机理

【数据介绍】

1）蛋白质定点标记

作者以绿色荧光蛋白（GFP）为例，验证了TAMM和蛋白质的生物正交反应活性（图2）。为了能在GFP上定点实现TAMM缩合反应，作者以遗传密码扩展技术构建了150-THzk-GFP，通过甲氧胺处理，将GFP上的THzk分子转化为Cysk，即氨基硫醇。通过利用带有罗丹明基团的TAMM分子与GFP混合，实现了蛋白质的定点标记，并用质谱技术对产物进行验证，证明了蛋白质标记的可行性。

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图2 TAMM缩合反应应用于GFP的定点标记

2）细胞膜蛋白质定点标记
为了进一步考察TAMM生物正交能力，本文验证了哺乳动物细胞膜上的TAMM和蛋白的定点标记。TEV酶可特异性地识别并切割底物多肽（ENLYFQ-C，切割位点在Q，C之间），暴露底物多肽的氨基硫醇位点。为在细胞膜上引入氨基硫醇活性基团，作者在细胞膜上表达了融合有底物多肽序列的m-cherry蛋白质。经TEV酶切激活后，暴露的氨基硫醇位点可与TAMM-fluorophore发生反应，从而可通过m-cherry和fluorophore共定位证明该正交反应的特异性（图3）。

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图3 细胞膜上蛋白质定点标记
3）噬菌体展示应用
本文还将TAMM缩合技术与噬菌体展示结合起来，设计了TAMM分子介导的噬菌体展示环肽库构建，并将抗凋亡蛋白Bcl-2（癌症相关）作为靶标，进行了ADT环肽噬菌体的筛选。该噬菌体展示多肽为CX9C，X为任意氨基酸，C为半胱氨酸，并且C经TCEP切割后可还原为N端游离的半胱氨酸，具有TAMM正交反应活性。此外，这里选择的TAMM分子还具有氯乙酰基团，氯乙酰基团具有巯基反应活性，可以与非N端的半胱氨酸发生正交反应，从而实现了展示多肽的环化，增加了该展示文库的拓扑结构复杂性。

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图4 TAMM缩合反应在噬菌体展示中的应用

【小结】

TAMM与氨基硫醇的生物正交反应展现出了生物相容性好、标记效率高、特异性强、适用范围广等优点，具有广泛的应用价值。同时，结合噬菌体展示技术，作者筛选出了对Bcl-2具有高亲和力的ADT环肽，为生物学研究和潜在的治疗方法提供了有价值的工具。此外，通过交联位置和结构的优化，可提高多肽文库的拓扑结构多样性，进一步提高多肽识别的亲和力、选择性及扩宽靶标范围等潜力。                                                                                                       

 

 

撰稿人：JIAJUN LING，JUNXIA WANG

校稿人：面面

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.9b11875


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