大自然用酶将翻译后的修饰位点选择性地安装到蛋白质上，从而极大地增加了蛋白质的结构和功能多样性。化学家相应地开发了一系列针对位点特异性蛋白质修饰的化学反应，靶向标准氨基酸或非天然氨基酸带有酸的（Uaas）具有生物正交的柄。针对天然残基最有用的蛋白质修饰化学方法是用亲电子试剂或氧化还原试剂与蛋白质上的亲核基团进行反应。但是使用亲核试剂直接修饰蛋白质具有挑战性，因为蛋白质的亲电基团生物相容性条件下不易反应。例如，Glu和Asp的羧基需要活化才能与胺反应。实际上，有效地标记具有对蛋白质反应性较低或惰性的化学功能性蛋白质是一个普遍的挑战。醌甲基化物（QM）是亲核试剂的出色迈克尔受体，反应速率常数高达到105至108M-1 s-1.25，其大小也与酪氨酸相当，反应产物的连接性也与氨基酸侧链相似。但QM反应活性高，无法直接引入蛋白质中。今日分享的是来自美国加利福尼亚大学LeiWang等研究人员的成果Genetically EncodedQuinone Methides Enabling Rapid, Site-Specific, and Photocontrolled ProteinModification with Amine Reagents，该文章发表在J.Am.Chem.Soc上。

作者报告了一种用光控制的方法对位点选择性蛋白质进行修饰和用胺试剂进行功能化。策略是将高反应性但也具有化学选择性的物种光笼化为蛋白质，将其原位释放允许与蛋白质惰性标记试剂选择性反应，以进行位点特异性蛋白质修饰。

作者设计并合成了两个有光笼QM在侧链的Uaas，分别是FnbY和FmnbY（图1）。

图1

作者先前从产甲烷单胞菌的tRNAPyl/ PylRS进化了一个正交的tRNAPyl / FnbYRS（将FnbY遗传掺入到大肠杆菌和哺乳动物细胞的蛋白质中），并证明了FnbY在紫外线激活后，仅当亲核侧链与QM接触时才使蛋白质的亲核氨基酸残基交联。但tRNAPyl/ FnbYRS对可能掺入率低。因此，作者将FnbYRS的突变移植到嗜甲甲基甲虫PylRS的PylRS中，合成的突变体合成酶（poQMRS）能够高效融合FnbY和FmnbY。tRNAPyl/ poQMRS与MBP-Z（24TAG）基因在大肠杆菌中共表达，仅当向培养基中添加FnbY（图2a）或FmnbY（图2b）时，才证明全长MBP-Z融合蛋白的存在，这表明FnbY或FmnbY的掺入。我们还通过在大肠杆菌中用tRNAPyl/ poQMRS表达位点6处含有TAG密码子的Ub基因，将FnbY或FmnbY掺入了泛素（Ub）中（图2c）。ESI-MS分析证实FnbY和FmnbY以高保真度掺入（图2d，e）。

图2

作者研究将FnbY和FmnbY分别遗传整合到Ub中，在室温、（50mM磷酸盐，200 mM NaCl，pH7.5）、水性条件下用各种胺衍生物标记Ub，使用质谱法测定胺-QM偶联效率。如图3所示，FnbY和FmnbY均可在紫外线激活后均介导蛋白质的有效胺-QM共轭（图3a-g）。与p-QM相比，o-QM具有更高的反应性，并且更容易暴露于蛋白质中和与蛋白质发生反应，即 FmnbY的结合效率高于FnbY。文中的各种胺衍生的功能分子易与胺-QM蛋白快速结合在一起，可通过FnbY/ FmnbY轻松将各种官能团安装到蛋白质上。因此，FnbY和FmnbY可以用作蛋白质快速化学转化的一般处理方式。还可通过FnbY/ FmnbY进行的QM-胺反应可作为一个平台，将各种生物正交功能快速安装到蛋白质上，并单击具有可调大小，疏水性和化学反应性的化学手柄（图3h）。

图3

接下来，作者将掺入FnbY/ FmnbY的蛋白质与生物物理探针的氨基衍生物和翻译后修饰模拟物进行了缀合。先将MBP-Z（24FnbY）蛋白与胺衍生的荧光团花青3一起孵育，并用紫外线（365nm）激活反应（图4a）。在SDSPAGE上分离反应混合物，并为Cy3荧光成像，结果显示Cy3通过胺成功结合到MBP-Z蛋白上-p-QM反应，MBP-Z相同（图4c）。然后，将MBP-Z或WTMBP-Z与10 mM生物素-（PEG）2-胺在有或没有紫外线（365nm）激活的情况下孵育（图4d）。然后用抗生物素抗体的Western印迹所示（图4e），MBP-Z（24FnbY）仅在紫外线激活下与生物素-（PEG）2-胺反应，MBP-Z一样也图4f）。

图4

质谱分析了偶联蛋白产物。在不存在胺亲核试剂的情况下，Ub在水性缓冲液中的单独紫外线激活导致释放的p-QM水解（图4g），与水一致在10mM生物素-（PEG）2-胺和紫外线的存在下，通过MS检测了与该生物素探针偶联的Ub，以及一小部分水解产物（图4h）。基于这些物种的强度，缀合效率为85％。在相似的条件下，生物素-（PEG）2-胺与Ub共轭的MS分析也证实了胺探针与光释放的o-QM的反应，标记效率超过95％（图4i）。这些结果共同表明，胺探针能够与H2O竞争，与蛋白质上的光释放QM反应，生成所需的蛋白质结合产物。

作者测试了标记在大肠杆菌细胞表面表达的含FmnbY的蛋白质（图4j）。在具有紫外线激活的细胞上观察到Alexa Fluor 488荧光。这些结果共同表明在大肠杆菌细胞表面成功标记了含FmnbY的蛋白质。作者设想，胺-QM偶联也可用于某些翻译后修饰模拟物的简便安装，以调节蛋白质特性。肽或蛋白质药物与聚糖的缀合是提高药物药理效力（例如细胞渗透，生物分布和半衰期）的可行策略。于是将Ub（6FmnbY）与含一个胺基的D-半乳糖胺一起孵育（50mM）。紫外光激活可以使该糖以80％的效率与蛋白质快速结合（图4k）。相反，用不含胺基的500mM D-葡萄糖对Ub进行类似处理则不会结合（图4l），证实了胺-QM的结合机理。通过FmnbY将糖缀合在酪氨酸羟基的邻位。遗传编码的FnbY和FmnbY均可用于通过光控胺-QM偶联高效高效地快速引入蛋白质修饰。胺衍生物的较高浓度和较强的亲核性通常由于与水水解的更有效竞争而导致较高的缀合效率。

将Ub与1mM或10 mM 1-硫代-β-D-葡萄糖一起孵育。反应产物的质谱分析表明，在两种条件下，1-硫代-β-D-葡萄糖几乎定量地与Ub结合，转化效率接近100％（图4m）。如图4l，当类似地使用500mM D-葡萄糖时，未检测到结合。我们还将有细胞毒性Mertansine（DM1，0.75mM）的硫醇衍生物与Ub一起孵育，发现它在30s内定量转化与Ub结合（图4n），可用于制备抗体-药物结合物。

p-QM在水中的半衰期仅为几秒钟，据报道o-QM比水溶液中的p-QM更具反应性。因此，胺-QM蛋白的限速步骤应该是从FnbY或FmnbY释放QM的光。作者用了UVP制造的3UV-38紫外灯分析MBP-Z（24FnbY）上的生物素标记，以在不同的时间段内激活反应（图5a）接下来，用紫外线灯（OmnicureS1000）来提高光强度，Ub与5mM生物素酰肼的反应在10秒钟内完成，而WTUb与5 mM生物素酰肼一起孵育即使暴露在相同的光波长和强度下也没有显示任何标记（图5b）。用质谱在不同的时间段进一步表征了Ub标记。以上数据表明光介导的胺-QM蛋白偶联是特异性的并且非常快。低功率紫外光标记和高功率紫外光标记条件的紫外线照射均不会显着影响液体培养基中大肠杆菌的生长。

图5

作者将MBP-Z（24FnbY）用Cy3-胺标记，并在0°C，4°C和室温（RT）下使用低功率紫外线灯产生QM。荧光成像显示标记反应在这三个温度下同样强大（图5d）。然后，用生物素酰肼标记MBP-Z（24FmnbY），并在这些温度下使用大功率紫外线灯生成QM。蛋白质印迹检测表明在三个温度下标记达到了相似的水平（图5e）。MS分析表明，当被高功率紫外灯激活10或30s激活时，每个温度下的标记几乎完成（图5f）。还表征了由生物素酰肼在0和4°C下通过低功率紫外线灯在不同的时间段激活Ub（6FmnbY）的标记动力学（图5g）。质谱显示标记在6分钟内达到85％，0和4°C之间无显着差异（图5h）。低温下胺-QM标记反应的优异相容性将有利于在蛋白质结合过程中保留不稳定的蛋白质。

在pH7.5的水溶液中于室温下孵育了苯胺或烯丙胺偶联的Ub24和48小时，然后进行了MS表征，表明该键在水溶液中稳定。还在pH5，pH 9或pH7.5中将烯丙胺偶联的Ub与强还原剂（50mM DTT）一起孵育了24小时，数据表明，胺-QM共轭产生的N-C键在水性缓冲液条件下稳定，可抵抗酸性或碱性变化以及蛋白质加工中常见的强还原条件。还评估用生物素胺在pH5.0、7.5和9.0标记了MBP-Z（24FmnbY）和在2.5M NaCl，10％甲醇，10％DMSO和10％DMF存在下的标记，结果表明胺-QM蛋白质缀合物与标记反应和蛋白质研究中常见的高盐和有机溶剂条件具有极好的相容性。

作者将自旋标记物4-aminoTEMPO（30mM）与Ub缀合。MS验证了结合及 81％的标记效率。还将该自旋标记物缀合至Ub，MS证明用1.5mM的4-amino-TEMPO产生87％的标记，50mM的产生100％。接下来，作者转向FnbY介导的自旋标记，以利用其较短的连接并获得较少的自旋标记的rotamer构象。对于带有两个TEMPO自旋标记的位点特异性标记的T4L上进行的DEER测量，通过遗传同时将FnbY掺入T4L的9和131位，然后与4-氨基-TEMPO结合（图6b）。双重标记的T4L的连续波EPR光谱显示出受限制的一氧化氮运动，表明TEMPO已成功标记到蛋白质上（图6c，d）。DEER实验突出了使用FnbY提供短链接的优势。与使用其他常见旋转标记获得的距离分布比较（图6g）表明FnbY-TEMPO方法接近于通过V1获得的窄分布标签。结晶了双标记的T4L蛋白，并以1.5Å的分辨率解析了其结构。晶体结构显示酪氨酸残基，其旋转标记分别缀合在残基9和131的β-碳原子上（图6h，i），从而证实了FnbY的掺入和4-氨基-TEMPO标记是通过胺-QM机理进行的。DEER测量的两个自旋标记之间的距离与在晶体结构中观察到的距离相符。这些结果表明，具有4-aminoTEMPO的FnbY介导的SDSL与蛋白质骨架提供了相对刚性的连接，使其成为进一步DEER应用的有价值的方法。

图6

作者开发了一种通用的通用蛋白质偶联方法，该方法颠倒了通用范例，直接使用弱亲电胺试剂进行蛋白质修饰和功能化。基于FnbY/ FmnbY的蛋白质修饰具有所需特性的罕见组合，可解决尚未解决的挑战。总之，这种标记策略具有位点特异性，快速动力学，光可控性，与低温的相容性，最小的扰动，最短的连接以及广泛使用的试剂的有利特征，将成为蛋白质研究和获取的有价值的工具生物和生物医学研究。

【文章链接】https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c06820