本周分享的是发表在chemical science上的一篇文章，题目是Azapeptide activity-based probes for the SARS-CoV-2 main protease enable visualization of inhibition in infected cells。通讯作者是来自鲁汶大学的Steven H.L. Verhelst教授，主要从事化学生物学和化学蛋白质组学方面的研究，致力于蛋白酶、激酶和通道/转运蛋白的新型化学探针的开发和应用。
SARS-CoV-2 主蛋白酶（Mpro）是一个经过验证的药物靶点，有许多的研究尝试开发针对该蛋白酶的抑制剂，其中所使用的很多化合物都带有能够与半胱氨酸反应的弹头。目前已经报道的Mpro 的不可逆共价抑制剂所使用的半胱氨酸反应性的弹头，包括酰氧基甲基酮 (AOMKs)、氮杂腈和吡啶基酯，以及迈克尔受体例如肽乙烯基酯和乙烯基砜。 有些研究中使用不可逆的共价弹头来制造基于活性的Mpro探针。Rut等人使用连接在由天然和非天然氨基酸组成的四肽上的乙烯基砜弹头针对 Mpro 的 P4-P1 偏好进行优化，Böttcher课题组通过文库合成得到探针。尽管上述研究提供了有用的探针，但两者都使用溶液相来构建探针。固相化学可以在更短的时间内建造更多种类的结构。Van de Plassche等人使用多肽固相合成 (SPPS) 以创建带有 AOMK 弹头的 ABP。然而，这种固相方法仅限于这种特定的弹头。因此，本文作者希望设计一个稳健的固相合成方法，允许多肽和反应性弹头有多种变化。SARS-CoV-2 Mpro 的主要特异性元件包括了一个在P1位置上的Gln残基，这可以作为将分子锚定在固相载体上的锚点。由于弹头位于P3-P1多肽识别元件的C端，作者选择使用氮杂肽，也就是在多肽主链中引入仲胺，使弹头可以与之耦合。先前已经有研究开发了用于各种半胱氨酸蛋白酶的共价氮杂肽抑制剂，此外，作者在之前的研究中证明具有 P1 aza-Asp 残基的caspase靶向抑制剂的固相合成是可行的。作者最初的目标是将溴丙酸偶联到 Rink 树脂上，然后与 Fmoc-肼反应。然而该反应失败了，因此作者在溶液中构建了关键块（化合物4）。从Boc保护的肼和3-溴丙酸叔丁酯开始，使用 Alloc chloride保护NH得到中间体3，然后脱除Boc 和OtBu。最后用Fmoc chloride重新保护边上的氨基得到4。化合物4通过羧基与Rink树脂偶联，接下来作者使用基于Fmoc的SPPS偶联上L-Leu 和 L-Tle。用己炔酸保护N端，然后脱除Alloc并连接半胱氨酸反应性弹头。作者通过酰胺键或磺酰胺键安装了五种不同的反应性亲电子试剂：环氧琥珀酸酯 (7a)、乙烯基磺酰胺 (7b)、富马酸甲酯 (7c)、氯乙酰胺 (7d)和 2-氯-5-硝基苯甲酰胺 (7e)。这些弹头以四种不同的方式与半胱氨酸发生反应方式，即环氧化物开环（7a），迈克尔加成（7b，7c），SN2取代（7d）和SNAr 取代 (7e)。
作者测试了这五个探针的IC50，探针 7a、7c 和 7d显示出低至中纳摩尔浓度的 IC50，而探针7b和7e的活性更低，IC50值超过45μM。接下来，作者评估了探针 7a、7c、7d 和 7e相对于人蛋白质组的选择性，均未发现脱靶。尤其是探针7c和7d，在次优的pH条件时仍有很强的选择性。作者还评估了两个最活跃的探针 7c 和 7d 用于标记的灵敏度，证明探针 7d 可用于检测受感染细胞中的活性 Mpro。最后作者通过荧光显微镜的实验证明探针 7d 可检测细胞中的内源Mpro活性，在使用抗病毒药物处理后荧光信号降低。
总之，作者在这项工作中报告了氮杂肽衍生的针对Mpro的ABP，可以可视化受感染细胞中的 Mpro 活性和及其抑制。原文链接：https://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2023/SC/D2SC04147B
原文引用：https://doi.org/10.1039/D2SC04147B
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