今天为大家推荐一篇发表在Cell上的文章，文章标题是“Dual-specificity RNA aptamers enable manipulation of target-specific O-GlcNAcylation and unveil functions of O-GlcNAc on β-catenin”。本文通讯作者是来自约翰霍普金斯大学的Gerald W. Hart教授和其课题组博士后Yi Zhu博士，Gerald W. Hart教授课题组专注于O-GlcNAc糖基化修饰在细胞生物学方面功能的研究。本文中，作者设计并构建了一类双特异性RNA适配体，成功对目的蛋白进行选择性地O-GlcNAc糖基化修饰，进而对其生物学功能进行操纵。
O-linked β-N-acetylglucosamine是一种重要的翻译后修饰（PTM），其可能参与到超过8000种蛋白的功能调控过程中。O-GlcNAc是一种由修饰酶OGT和去修饰酶OGA共同维持的高度动态的翻译后修饰，通过与磷酸化进行相互作用，进而能够对细胞内多种信号通路进行调节。为了对这一修饰的具体分子功能进行探索，此前的研究者通过半合成的手段或者基于抗体特异性靶向的策略，试图对目的蛋白的O-GlcNAc功能进行研究。然而，这些策略一方面可能无法在细胞中原位的进行O-GlcNAc修饰的调控，另一方面可能无法避免抗体持续结合带来的影响。为了解决这一问题，作者构建了双特异性RNA适配体。首先，通过SELEX筛选，研究者成功筛选到靶向OGT的特异性RNA适配体T1，在对OGT具有非常高的亲和力的同时，也不影响OGT的活性。同时，他们发现，这样的适配体有着较短的半衰期（16.18 min），这就很好地在调控功能的同时，避免了持续结合带来的副作用。通过优化连接子，他们成功将T1和AP3连接，实现了对OGT和GFP的同时靶向。结果显示，这样的双特异性适配体能够成功调控目的蛋白β-catenin上的O-GlcNAc修饰水平，并且这一修饰完全依赖于OGT的催化活性。此外，通过联合使用非天然糖GalNAz和8.5 kDa的质量迁移PEG标签，他们成功观测到适配体依赖性质量迁移的发生，即标志着适配体能够介导新的O-GlcNAc的生成。至此，基于RNA的能够同时靶向OGT和GFP的双特异性适配体成功构建完成。
有了这一工具，作者对目的蛋白β-catenin的生物学功能进行探索。结果显示，适配体的引入抑制了β-catenin与其相互作用蛋白β-TrCP之间的相互作用，进而抑制了β-catenin的降解过程。进一步探索，他们意识到，这种抑制作用不是通过抑制磷酸化水平得到的，而是利用O-GlcNAc的空间位阻得到的。这一机制最终提高了目的蛋白β-catenin的稳定性，使其能够持续激活下游信号。后续实验中，研究者还筛选出了靶向内源β-catenin的RNA适配体，并发现与上述结果基本一致，证明了其策略的可靠性。而在内源水平上，β-catenin上的O-GlcNAc水平上调后，β-catenin与EZH2蛋白的相互作用被进一步强化，进而使EZH2被招募到启动子附近，由此转变转录组。文末，作者还尝试联合核糖开关和诱导表达系统，由此实现目的蛋白上O-GlcNAc水平的诱导调控。综上，本文作者设计并构建了同时靶向OGT和目的蛋白β-catenin的双特异性适配体系统，成功实现目的蛋白上O-GlcNAc糖基化水平的调控，进而其分子机制进行探索。这一工具为O-GlcNAc修饰在细胞中的蛋白，特别是单种蛋白上的精确功能的研究提供了思路与基础。
本文作者：KLH
原文链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(22)01529-X文章引用：DOI: 10.1016/j.cell.2022.12.016
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