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为大家分享一篇发表在ACS Cent. Sci.上的文章“A Cell-Permeant Nanobody-Based Degrader That Induces Fetal Hemoglobin”。本文的通讯作者是斯坦福大学的Laura M.K. Dassama教授和哈佛医学院的Stuart H. Orkin教授。Laura M.K. Dassama教授主要研究方向为耐药性相关的多药转运蛋白的分子识别机制,天然产物的合理工程化和再利用,镰状细胞病相关转录因子的控制。Stuart H. Orkin教授主要研究血液系统的发育和功能,癌症和干细胞之间的关系,以及干细胞自我更新和从胎儿到成人血红蛋白转换的机制。
蛋白水解靶向嵌合分子(PROTACs)和分子胶降解剂,如免疫调节亚胺药物,劫持细胞蛋白泛素化机制特异性降解感兴趣的蛋白质(POIs)。邻近蛋白质降解策略在医学上具有巨大的治疗潜力,但该技术仅限于存在小分子配体的蛋白质。开发靶向临床治疗相关但“无药可及”蛋白质的配体仍具有非常大的挑战性。本文中,作者利用酵母表面展示合成纳米抗体来获得具有BCL11A蛋白选择性的蛋白配体,BCL11A是胎儿珠蛋白基因转录的关键抑制因子,胎儿血红蛋白是镰状细胞病和β-地中海贫血临床严重程度的调节剂。该方法的主要思路是将纳米抗体融合到一个细胞渗透性的微型蛋白和E3适配器上,从而产生一种降解剂,能够在分化的原代红细胞前体细胞中耗尽细胞BCL11A,从而诱导胎儿血红蛋白的表达。
作者首先进行了靶标选择和配体筛选。尽管预计BCL11A在很大程度上是非结构化的,但该蛋白包含几个有序区域,包括一个可能介导自我关联的CCHC型锌指结构域(ZnF0)和6个C2H2型锌指结构域(ZnF1、ZnF23和ZnF456),作者推测这种折叠良好的结构域可以用来鉴定BCL11A的Nb配体。由于BCL11A及其旁系物BCL11B在所有锌指区域的序列相似,与这些结构域结合的配体可能对这两个旁系物都具有亲和力,从而导致特异性降低。为了获得BCL11A配体的特异性,作者生产了ZnF23和一个“扩展”锌指结构域(exZnF23),从而使得两个蛋白的C端无序区域在序列上形成差异。延伸的蛋白质片段与BCL11B相似率69.3% (ZnF23片段相似率93.2%),在大肠杆菌中表达并纯化,重组蛋白用于酵母表面展示筛选,以鉴定合成的Nbs结合物。一个初始Nb hit (wt2D9)在大肠杆菌中产生,通过随机突变和筛选获得2D9_V102G(以下简称2D9)和2D9_W108L,它们由于稳定性、高亲和力和对BCL11A的exZnF23的特异性而被选作进一步研究对象。用于损耗BCL11A的配体必须被传递到红细胞先体细胞的细胞核中。由于Nbs太大,电荷对穿过质膜不利,所以作者通过在2D9上添加一个称为ZF5.3的细胞渗透微型蛋白来实现细胞穿透的功能化。
在证明了ZF5.3-2D9穿透HUDEP-2细胞并与BCL11A结合后,作者使用细胞穿透Nb作为工具来介导蛋白酶体对BCL11A进行降解。与小分子PROTAC不同,使用再造E3连接酶的“全蛋白”降解物据报道称能够对各种靶标表现出高灵活性。在这里,作者通过将两种泛素E3连接酶,工程化的SPOP(散斑型POZ蛋白)和RNF4,结合到他们的设计中,设计了基于细胞的纳米抗体BCL11A降解物。之所以选择这些E3连接酶,是因为它们在细胞核中的丰度很高,而且它们以前被用来介导核蛋白的降解。用蛋白酶体抑制剂(MG-132)处理可以阻止BCL11A的降解,从而证实蛋白的丢失是通过蛋白酶体降解以配体依赖的方式进行的。
总的来说,该策略提供了一种通过对BCL11A进行可逆的、暂时的调节来诱导胎儿血红蛋白表达的方法。此外,本文开发出的蛋白类PROTAC分子为以前难以处理的蛋白质的靶向降解建立了一个新的范式。
本文作者:WQW
责任编辑:MYZ
原文链接:https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acscentsci.2c00998
原文引用:DOI:10.1021/acscentsci.2c00998
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