ACS Chem. Biol. | 光催化多肽C端标记技术促进单分子蛋白质组学发展

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分享一篇发表在ACS Chemical Biology上的研究文章：Photoredox-Catalyzed Decarboxylative C-Terminal Differentiation for Bulk- and Single-Molecule Proteomics1，通讯作者有堪萨斯大学药学院的Steven Bloom教授、得克萨斯大学奥斯汀分校自然科学学院的Edward M. Marcotte教授和化学系的Eric V. Anslyn教授。

蛋白质质谱(MS)、基于荧光或纳米孔的蛋白质测序以及其它蛋白质鉴定与定量方面的技术进步，给蛋白质组学发展带来新的契机。就MS来说，创新的交联策略来研究蛋白-蛋白互作、同位素标记多肽以进行定量的方法开发备受关注；于单分子蛋白质测序而言，亟需发展新的报告基团能够区分带有相同活性官能团的残基，例如，选择性标记都含有游离羧基的天冬氨酸、谷氨酸和C-端残基。专门针对多肽末端标记主要有以下优点：

  • 几乎所有肽中存在，有助实现全面标记；

  • 远离活性位点，减少对蛋白活性的影响；

  • 空间或构象限制小，方便标记反应发生。

不少既往研究表明，同种蛋白质的C端修饰可以丰富多样，另外这里也可发生独特的水解反应，与众多生物学过程相关，比如RNA转录和蛋白质聚集等。当前已有不少手段能够做到高效、特异地标记N端氨基，而对于肽链另一头的游离羧基，相应方法却是寥寥无几。究其原因在于，侧链羧基和C端羧酸的反应活性极为相似，且通常样品中前者出现的频率更高。近年来，经由光催化氧化还原C端脱羧的策略已在十肽以下的目标物中得到初步验证，显露出广泛应用的潜力。本次研究中，作者团队优化和评估了用于“自下而上”蛋白质组学的光催化C端脱羧-烷基化标记方法的可行性，并详细介绍了实验的仪器配置和方法条件。

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图1.  (A)进行光催化氧化还原反应的实验平台，主要组件包括：(a)台扇与主动冷却系统、(b)反应器皿、及(c)445nm蓝色发光二极管（LED）阵列；(B)反应方程式与实验条件。

考虑到Lumidox II系统（图1.A）支持多达96种光催化氧化-还原反应并行，是小规模反应条件优化和性能评估的最佳平台，团队以血管紧张素II（H2N-DRVYIHPF-CO2H）为模型多肽，利用一种迈克尔受体3-亚甲基-2-降冰片酮（NB）作为标记物，在光黄素的催化下探索标记反应的最佳实验条件。综合反应效率、质谱信号强度等多种因素，最终确定实验条件为甲酸铯缓冲液(pH 3.5)提供酸性环境，5%二甲亚砜(DMSO)(v/v)作为溶剂，反应时间6h，LED功率设置为110 mW，并使用10当量的NB（浓度1 mM），具体如图1.B所示。此外，为减少巯基的竞争反应，需提前用碘乙酰胺封闭。

荧光测序技术（fluorosequencing）能以单分子分辨率水平实现对复杂混合物的序列测定。通常来说，首先需要用荧光团选择性地标记各氨基酸，将目标物固定在载玻片上后，进行连续的几轮Edman降解（反应在蛋白N端发生，所以原则上选择固定C端），同时监测随之发生的荧光变化，凭此推断出被标记氨基酸在肽链中的位置。引入新开发的C端羧基标记技术后，针对性地优化迈克尔受体的侧链结构，不仅能实现更加特异的多肽固定化，还利于其它试剂和非端位游离的酸性基团反应，方便后续分析。接下来，研究团队以血管紧张素II为例（流程如图2所示），具体展示了新方法带来的革新。

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图2.  方法主要步骤解说。


统计结果如图3所示，经过首个正式Edman循环，血管紧张素-炔烃组（蓝色）的荧光损失最多，由此能够推测带有该荧光团的天冬氨酸处于肽链的N端端位。相比之下，血管紧张素-NB组（橙色）荧光损失强度要低数十倍，间接体现了C端脱羧-烷基化对荧光测序效果提升的显著贡献。

3图3.  荧光测序结果统计。若带有荧光标记的残基在某个Edman循环中被降解，则荧光丢失，纵轴统计了每个循环中肽段荧光丢失的频次。其中，血管紧张素-炔烃、血管紧张素-NB与阴性对照分别用蓝、橙、灰三色条形表示。值得说明的是，由于血管紧张素-NB组不带炔基，只能在载玻片上非特异性结合；阴性对照是C端酰胺化处理的非荧光化肽段，用于评估图2第四步残留荧光团的背景影响。


为了更好地了解C端标记在蛋白质组学研究中的适用性，选用胰蛋白酶和GluC分别处理了牛血清白蛋白（BSA）、酵母细胞裂解液和人细胞裂解液，然后将样品根据催化剂光黄素的存在与否分成实验组和对照组，都进行C端标记。C-18柱除盐后，开展LC-MS/MS分析，并利用软件主动检索NB修饰（C端+78.083 Da）。以修饰肽匹配数除以总的肽段匹配数（PSM）作为衡量C端标记效率的依据，结果见图4。

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图4.  分别用A）胰蛋白酶、B）GluC处理酵母裂解液、人细胞裂解液和BSA后，样品的C端标记效率结果比较；C）胰蛋白酶-酵母的对照组（灰色）与实验组（蓝色）质谱数据分析结果的高置信PSM分布图。（PSMs: peptide spectral matches）


由上图可以看出，不同酶消化产物的标记效率不同，这可能是因为两种蛋白酶产生的不同末端氨基酸（K/R vs. D/E），说明方法还是存在一定的氨基酸偏好性。有趣的是，比较对照组和实验组检索到的多肽丰度，即使换成基于MSFragger的开放检索策略，最终实验组总的高置信PSM还是相对平均减少了76%（图4.C）。作者认为，在这种催化剂作用下，LED辐照能引起蛋白质降解加剧而导致丰度降低，可以考虑改为其它催化剂、缩短辐照时间等等，是后续研究主要待解决的问题。不过，尽管产率降低，但现有方法在标记混合多肽的C端时，还是体现出高度的选择性。

综上所述，本项研究首先使用内源性血管紧张素作为目标底物来优化光催化多肽C端标记的反应条件，并证明了脱羧-烷基化在单分子蛋白质组学分析（即荧光测序）中的效用。作者预计这项技术将广泛用于蛋白质组学研究。




撰稿：梅沐轶

编辑：李惠琳

文章引用：Photoredox-Catalyzed Decarboxylative C-Terminal Differentiation for Bulk- and Single-Molecule Proteomics. ACS Chemical Biology 2021.



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