为大家介绍一篇发表在ACS Chemical Biology上的文章，题目为Phosphorothioate-Based Site-Specific Labeling of Large RNAs for Structural and Dynamic Studies。本文的通讯作者是来自清华大学生命科学学院的方显杨教授，其致力于非编码RNA的整合结构生物学研究。
脉冲电子-电子双共振（PELDOR）、X射线散射干涉法（XSI）和单分子荧光共振能量转移（smFRET）都是提供纳米范围内的分子间或分子内成对距离分布的分子标尺，适用于包括RNA在内的生物分子的结构和动态研究。这类方法首先需要分别使用自旋标记、金纳米粒子和荧光标记对生物分子进行位点特异性标记。最近，由非天然碱基对（UBP）NaM-TPT3构建的长片段基因经转录后，通过UBP的碱基部分引入标记实现了长片段RNA的位点特异性标记。然而，由于引入标记的结构庞大，可能导致RNA整体结构的扰动并影响测量数据的准确性。本文中，作者合成了α-硫代磷酸酯修饰的rTPT3TP（rTPT3αS），马来酰亚胺修饰的探针可以与硫发生反应，不仅实现了长片段RNA的特异性标记，而且该方法引入探针时对结构的扰动更小。随后的PELDOR、XSI和smFRET测量值分布比在TPT3碱基位置进行标记时更窄。所以，该方法有望实现更大的RNA及其复合物的精准结构解析和动力学研究。RNA是重要的生物分子，在多种细胞过程中发挥作用。RNA的功能多样性源于它们能够形成不同的三维结构并根据需求发生构象变化。对RNA结构、相互作用和构象动力学的研究有助于解读RNA的功能，开发基于RNA的靶向治疗策略。由于RNA的固有灵活性，使用X射线晶体学和低温电子显微镜等技术对RNA进行结构表征具有挑战性。核磁共振波谱（NMR）以及小角度X射线和中子散射（SAXS/SANS）技术可以获得相对灵活的RNA或RNA-配体的准确结构和动力学信息。然而，NMR仅限于短RNA (50-60 nts)，并且SAXS/ SANS的分辨率相对较低。目前，多技术联用表征RNA的结构、相互作用和构象动力学的优势逐渐显露，而且可以将不同分辨率和多种技术的实验数据与计算建模相结合。在这些技术中，PELDOR、XSI和smFRET作为分子标尺可以测量分子内或分子间距离在纳米范围的分布。许多研究表明，距离分布以及高分辨率的结构信息和计算模型在研究RNA和RNA蛋白复合物的整体结构和构象动力学方面具有很高的参考价值。近年来，科学家开发了多种用于RNA位点特异性标记的方法。RNA可以通过固相化学合成或RNA聚合酶催化的体外转录反应制得并进行结构研究。在RNA合成过程中或合成后，不同的探针可以共价连接在RNA的核苷酸碱基、糖环或磷酸骨架上。化学合成一直是用于位点特异性RNA标记的最流行和最通用的方法，但RNA长度受到限制（小于100 nts）。最近，通过非天然碱基对（UBP）扩展遗传编码系统的转录引入特异性位点，再经由点击化学或胺-NHS酯反应的转录后修饰策略，实现了对长片段RNA(700 nts)的位点特异性标记。该方法克服了常规RNA标记方法中的长度限制，并且可以在生理条件下有效进行。核酸中一种常用的功能性修饰是硫代磷酸酯（PS），即磷酸骨架中的硫代替了一个非桥连的氧原子。除可以提高稳定性外，PS修饰提供了亲核位点，该位点可以通过含有碘乙酰胺或马来酰亚胺的标记物进行特异性烷基化。与碱基标记方法相比，PS标记具有许多潜在优势。首先，这种单原子取代对核酸结构的扰动较少。其次，由于磷酸二酯键不参与碱基配对，对核酸的双链稳定性和结构影响较小。最后，PS的修饰成本更低。本文中，作者制备了α-硫代磷酸酯修饰的rTPT3TP(rTPT3αS)，展示了其在转录后位点特异性标记几种97-719 nts的RNA中的应用，包括来自嗜热脂肪芽孢杆菌的核糖核酸酶P (RNase P)以及来自登革热病毒2 (DENV2)的3’茎环结构(3’SL)和微型基因组(mini genome) RNA。含有NaM-TPT3 UBP的系统转录获得含有rTPT3αS的RNA，随后发生硫醇-马来酰亚胺反应，以位点特异性方式将氮氧自旋标记、金纳米颗粒和荧光团共价连接到RNA的磷酸骨架上。通过PELDOR、XSI和smFRET进行分析，结果表明磷酸骨架标记比碱基标记的RNA测量值更加准确，对结构扰动更小。图1. rTPT3αS的合成和磷酸骨架特异性标记策略首先，作者成功制备了α-硫代磷酸酯修饰的rTPT3的三磷酸单体，在转录完成后通过硫醇-马来酰亚胺反应引入特异性位点标记。其中，位点标记使用的探针为修饰了马来酰亚胺结构的纳米金颗粒，氮氧化合物自旋标记和荧光染料(sCy3)（图1）。图2. 通过NaM-TPT3 UBP引入PS特异性标记位点随后，作者通过含有dNaM-dTPT3的引物对质粒进行PCR，获得了含有UBP的双链DNA。在T7 RNA聚合酶的催化下，双链DNA转录获得成功掺入了rTPT3αS的RNA，得到用于特异性标记的硫醇位点。其中，rTPT3αS包含两种非对映异构体（Rp,Sp），只有Sp 是T7聚合酶的良好底物，获得了单一的全长转录产物（图2）。图3. 硫代磷酸酯修饰对RNA的整体结构和功能影响较小为了研究PS修饰对RNA结构和功能的影响，作者首先使用SAXS表征了rTPT3αS修饰的RNase P和3’SL RNA。单个或双rTPT3αS修饰的RNase P RNA和3’SL RNA的散射曲线与相应的野生型RNA的散射曲线重合。所有散射曲线的吉尼尔（Guinier）拟合都是线性的，表明所有RNA样品在溶液中都是单分散且均匀的。单个或双rTPT3αS修饰的RNase P RNA和3’SL RNA的配对距离分布函数与相应的野生型RNA的配对距离分布函数相似。rTPT3αS修饰的RNA的旋转（Rg）和最大直径（Dmax）与相应的野生型RNA相似，表明PS修饰不会引起明显的结构扰动。作者接下来研究了rTPT3αS修饰是否影响RNase P催化活性。在存在野生型和双rTPT3αS修饰的RNase P RNA的催化下切割酵母pre-tRNAPhe获得中间体tRNAPhe产物，表明PS修饰不会影响RNase P RNA的催化活性。随后作者研究了PS修饰是否会干扰3’SL功能。作者通过体外电泳迁移率变动分析（EMSA）对双rTPT3αS修饰的3’SL和含有3’SL互补序列的DENV 5’SLB-DAR的互补配对和折叠情况进行分析。结果表明，野生型和双rTPT3αS修饰的3’SL与其在 5’SLB-DAR中的互补序列相互作用形成杂交双链RNA，表明PS修饰不影响3’SL RNA的折叠和结合活性。总之，PS修饰对RNase P和3’SL RNA的结构和功能的干扰很小（图3）。图4. PS或碱基位点特异性自旋标记和PELDOR的距离分布测量比较接下来，为了确认PS-马来酰亚胺氮氧自旋标记的成功偶联，作者在室温下测量了氮氧自旋标记的rTPT3αS修饰RNA的X波段连续波电子顺磁共振（CW-EPR）光谱，并将其与碱基氮氧自旋标记的RNA (rTPT3CO)进行了比较。CW-EPR光谱的线形由氮氧化合物的重新定向动力学（旋转运动）决定。随着氮氧化合物运动的减少，U67、U86的单PS修饰（SSL）和双PS修饰（DSL）的g因子和超精细张量的分布变得不完全，导致线展宽，并在低场和高场区域出现额外特征。所有PS修饰标记的RNA光谱显示宽线，表明氮氧化物的运动性大大降低，这与氮氧化物成功共价连接到RNase P RNA的预期一致。然而，rTPT3CO测得的结果表明，碱基部分的氮氧自旋标记具有更宽的ΔHpp和2Aeff，即PS处的氮氧标记比碱基处更加牢固。随后，作者通过PELDOR对DSL RNase P RNA进行距离测量。图4C显示了经过背景校正的X波段PELDOR迹线，结果表明了偶极振荡的发生，绝对调制深度约为35%，与测得的高标记效率一致。作者通过Tikhonov正则化方法分析了两种不同修饰，其中rTPT3αS获得的距离分布很宽，5.3 nm具有最高的尖峰，在4.6和2.3 nm处有两个次要峰值（图4D）。rTPT3CO同样显示三个尖峰，可能是由于取代残基的局部动力学引起的。根据 RNase P (PDB ID：2a64)的晶体结构，U67和U86（标记位点）各自的N1原子之间的距离为3.32 nm。作者使用ALLNOX对U67和U86都被rTPT3替换的RNase P RNA进行测算，其距离增加到4.9 nm。考虑到大RNase P RNA的固有灵活性、PS的局部动力学以及包括缀合单元在内的MSL氮氧化合物的大小，作者认为测得的距离分布是合理的（图4）。图5. PS或碱基位点特异性金纳米标记和XSI距离分布测量比较接下来，作者通过TPT3的PS与马来酰亚胺金纳米颗粒或者碱基部分的氨基与单磺基琥珀酰亚胺的反应成功将金纳米标记引入RNA。为了证明基于PS的长片段RNA纳米金标记的适用性，作者通过XSI测量了3’SL中A67和U97位点之间的距离分布。与未标记的3’SL样品相比，PS单标记和双标记的q范围显示出散射强度的显着增加，RNA与一个或两个强烈散射X射线的纳米颗粒的稳定缀合一致。此外，PS双标记的纳米金-纳米金散射干涉曲线显示出明显的振荡，具有比碱基标记更加刚性的距离分布。因PS双标记的散射干涉分布的变换，导致测得的距离分布均值为75.8 Å，方差为48.5 Å2。未标记时两个P原子之间的距离为84.0 Å，因纳米金的半径和接头的固有长度，所以3’SL RNA两个标记的距离分布与原始未标记状态是基本一致的。然而，碱基纳米金标记却展现出了与未标记更大的距离分布差值。另一方面，与碱基纳米金标记相比，PS纳米金标记方法导致干涉分布中的更大的第一振荡倾角和更短但更尖锐的距离分布（协方差: 48.5 vs 52.7 Å2，图5）。图6. PS或碱基位点特异性荧光标记和smFRET构象动力学测量比较最后，作者通过PS或者碱基位点特异性的引入了sCy3荧光标记，sCy3标记的RNA进一步与5’-生物素和3’-Cy5标记的DNA寡核苷酸退火以产生正交标记的RNA并实现表面固定。作者收集了从不同荧光标记的RNA发出的时间依赖性sCy3和Cy5荧光信号。FRET效率(EFRET)是根据数百个单个分子的sCy3和Cy5强度计算得出的，它反映了sCy3和Cy5标记位点之间的分子内距离。其中将FRET事件的数量与FRET值作直方图，显示了3’SL30-αS和DENV-mini30-αS的主峰，并进一步通过高斯拟合提取其峰中心。3’SL30-αS和DENV-mini30-αS的EFRET峰值分别为0.80 ± 0.01和0.99 ± 0.01。此外，EFRET值为0.99的90%追踪信号首先发生Cy5的降低和sCy3的增加，随后sCy3降低，即Cy5和sCy3之间可能极少或没有发生染料-染料淬灭效应。因此，EFRET的变化表明3’SL经历了显著的构象变化，并且3’SL中标记位点之间的距离在基因组环化后变短。上述结果同原子模型中残基P1原子之间的直接测量距离一致。另一方面，相同条件下3’SL30-base RNA的FRET效率直方图显示出更宽的分布，其EFRET峰值为0.63 ± 0.01。鉴于rTPT3碱基标记的体积庞大及其更长的接头，3’SL30-base RNA的sCy3和Cy5标记位点之间的距离变长是合理的。此外，3’SL30-base RNA的FRET效率分布比3’SL30-αS RNA的FRET效率分布更宽。这些结果与上述PELDOR和XSI测量结果一致，即在磷酸骨架上标记的功能探针导致的距离分布比在基部上的距离分布窄（图6）。总之，作者合成了α-硫代磷酸酯修饰的rTPT3TP，展示了其在转录后位点特异性标记几种长片段RNA中的应用。其中，作者分别对其进行了纳米金标记、氮氧自旋标记以及荧光标记的验证，均成功缀合。同时作者对磷酸骨架标记后对结构的影响通过多种方法进行测量。结果表明，较碱基部分进行标记的策略而言，磷酸骨架上进行标记对结构的扰动更小。虽然相较于点击化学而言，硫醇-马来酰亚胺的效率稍低，但其在长片段RNA的结构及动力学的研究中有望获得更加准确的结果。https://doi.org/10.1021/acschembio.2c00199原文引用：10.1021/acschembio.2c00199
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