今天给大家分享的文献发表在ACS Chemical Biology上，标题为Dihydrouridine in the Transcriptome: New Life for This Ancient RNA Chemical Modification，通讯作者是巴黎第六大学的Djemel Hamdane研究员。

二氢尿苷（D）是tRNA中最丰富的修饰核苷之一，该修饰主要存在于tRNA中，在细胞生长中发挥着重要的生理作用。在本篇文章中，作者总结了目前用于检测D的化学标记方法、D在转录组中的分布、D合成酶家族的结构和机制以及该修饰在翻译和癌症生物学中的相关性。

D是由尿苷嘧啶环的C5-C6双键还原形成，C5-C6键对其化学反应性产生重要的影响，已被用于RNA标记和D位点定位。在碱性条件下，硼氢化钠（NaBH₄）可以还原D使嘧啶环打开，并消除脲醛部分来标记核糖(图1)。有几种RNH₂化合物（例如胺、肼）在原则上可用于取代tRNA内的3-脲基丙醇，这为tRNA标记和测序应用开辟了一条道路。在酸性条件下，D在过量NaBH₄存在下转化为四氢尿苷，通过亲核取代其C4位羟基来直接标记(图1)。可以利用核糖核酸酶处理RNA，然后使用质谱法分析寡核苷酸片段来分析转录后修饰。

图1 化学标记D位点的方法

D通常存在于细菌和真核tRNA的多个位置中，其丰度因生物体和tRNA类型的不同而有所差异。例如，在原核生物中有多达五个位点存在D(图2A)。D在rRNA中并不丰富，在大肠杆菌23S rRNA结构域V的中央环中仅有一个位置观察到D，在生孢梭菌的23S rRNA中有两个位置观察到D(图2B)。最近，通过分析发现D存在于裂殖酵母和人类mRNA中，在裂殖酵母转录组中检测到的D位点中，有38%和61%分别存在于mRNA和tRNA中(图2C)。在125个含D的裂殖酵母mRNA中，只有两个mRNA（编码非经典出口蛋白和丙氨酸tRNA连接酶）至少携带三个不同的D位点(图2D)。

图2 D在转录组中的分布

到目前为止，已经解决了三种细菌Dus同源物的结构，即嗜热链球菌的DusA、大肠杆菌的DusB和DusC。嗜热链球菌DusA和大肠杆菌DusC与tRNA复合物的结构阐明了细菌酶识别tRNA底物的分子基础(图3A、B)。人类Dus2(hDus2)对tRNA底物的识别机制十分复杂，dsRBD(双链核糖体结合位点）是一个双链RNA（dsRNA）的识别模块，目前可以得到hDus2 dsRBD与双链RNA复合物的结构(图3C)。hDus2/tRNA复合物的模型表明，dsRBD提供了一个重要的底物识别平台(图3D)。

图3嗜热链球菌DusA、大肠杆菌DusC和人类Dus2识别tRNA底物的分子基础

通过对酵母Dus2的研究，初步阐明了Dus的化学机制，这些酶的催化循环与大多数黄素酶一样由两个步骤构成(图4A)。另一种是NADPH还原Dus中黄素的立体化学机制，结果表明，Dus2对NADPH的前置氢具有特异性(图4B)，NADPH将FMN（氧化型黄素单核苷酸）还原为对苯二酚。在该反应中产生的对苯二酚的形式是FMNH^-（半醌型黄素单核苷酸）而不是FMNH₂（还原型黄素单核苷酸），这一点得到以下事实的支持：所有的Dus结构在其面对N1-异咯嗪的活性位点时保留了赖氨酸残基（hDus1、hDus2、hDus3、hDus4、嗜热链球菌DusA、大肠杆菌DusC中的K147、K155、K435、K158、K132、K139），并且稳定了黄素氮上形成的负电荷。另一个活性位点的谷氨酰胺残基（分别在hDus1、hDus2、hDus3、hDus4、嗜热杆菌DusA和大肠杆菌DusC中的Q79、Q87、Q365、Q87、Q63、Q68）将两个氢键与FMN的C2=O和N3H结合，以帮助稳定FMNH⁻(图4C、5A)。

图4 Dus催化D合成的化学机理

与tRNA复合的细菌Dus和hDus2的结构表明，没有足够的空间同时容纳NADPH和目标尿苷。因此，在通过NADPH还原FMN后，反应的第一个产物NADP⁺必须离开活性位点以调节第二个底物，FMNH⁻在C6处将其氢化物进行转移，然后在C5处进行质子化(图5B)。而在氟尿苷存在下将形成共价Dus/RNA复合物来抑制Dus活性(图5C)。

图5 D生物合成的化学机制和Dus的活性抑制

由于D在翻译中的重要性，转录后RNA修饰和催化它们的酶的缺陷通常与严重的人类疾病有关。在某些癌症中也可能出现某些修饰过度表达的情况，然而将异常RNA修饰与人类疾病联系起来的分子机制尚不完全清楚。对于二氢尿苷，在某些癌症中观察到两种情况：D含量增加和Dus过度表达。未来应特别注意对D在癌症生物学中的相关性的研究。

综上所述，文章第一次全面综述转录组中的二氢尿苷，具体讨论了其结构特性及其在转录组中的分布、二氢尿苷的标记和检测、二氢尿苷合成酶的结构和机制及病理意义。在作者看来，本篇文章初次揭示该修饰在蛋白质翻译中潜在的生物学作用，要完全理解D合成的酶学还需要完成不少工作，如D似乎能稳定tRNA，而不能稳定dsRNA，这一点需要进一步研究，以及探究D是否可以像其他类型的修饰一样，实现其他潜在功能，同时为了更好地理解这种修饰碱基的重要性，需要在转录组范围内更精确地定位D，必须突破大型测序技术带来的障碍，因此未来仍有许多问题需要进一步解决。

文章编号：54

原文链接：

https://doi.org/10.1021/acschembio.2c00307

原文引用：

Damien Brégeon, Ludovic Pecqueur, Sabrine Toubdji, Claudia Sudol, Murielle Lombard, Marc Fontecave, Valérie de Crécy-Lagard, Yuri Motorin, Mark Helm, and Djemel Hamdane. (2022), Dihydrouridine in the Transcriptome: New Life for This Ancient RNA, ACS Chem. Biol. DOI:https://doi.org/10.1021/acschembio.2c00307.