为大家分享一篇发表在ACS chemical biology上的文章——“Photoredox-Catalyzed DecarboxylativeC‑Terminal Differentiation for Bulk-and Single-Molecule Proteomics”：一种用于大分子和单分子蛋白质组学的光催化碳端脱羧烷基化方法。

  目前和新兴蛋白质组学技术（如单分子荧光测序）的工作流程中，正在开发和使用肽上连接生物功能基团的选择性标记方法。要使用任何一种方法成功标记，都需要肽片段包含设计标记化学的官能团。实际上，无论蛋白质切割位点如何，仅有两个官能团会存在于每个肽段中，即N末端的氨基和C末端的羧基。因此，开发一种全局标记技术需要专门针对肽的N端和C端。本文展示了光催化C-端脱羧烷基化在肽质谱和单分子蛋白质测序中的首次成功应用，且该方法可广泛应用于任何蛋白质组。还证明了由牛血清白蛋白酶消化产生的复杂混合物中的肽，以及来自酵母和人类细胞提取物的蛋白质混合物，都可以用迈克尔受体在其C端残基进行位点特异性标记。最后，该文章将C端脱羧标记与正交羧酸标记技术串联起来，建立了一个新的荧光测序平台。

  蛋白质质谱（MS）的进展，以及单分子蛋白质测序技术的发展，以及蛋白质检测和定量的其他进展，为蛋白质组学带来了一些新的机遇。比如：

（1）发现新的微蛋白

（2）部署单细胞蛋白质组学

（3）发现新的临床诊断工具。

绝大多数现有应用利用肽和蛋白质的共价标记技术，许多是针对生物源氨基酸（AA）残基中的特定功能组设计的。

  单分子蛋白质测序方法的发展也导致了对标记化学物质的显着需求，这些化学物质可以区分肽中发现的特定氨基酸残基，特别是那些具有共同官能团（例如，赖氨酸和 N 端残基的胺，以及天冬氨酸、谷氨酸和 C 末端残基的羧酸）。解决这些问题的一种方法是开发和利用专门针对肽链C或N末端的标记技术。这些末端

(1) 天然存在于几乎所有肽中；

(2) 通常从肽的活性结合位点去除，这意味着标记这些位置将不太可能干扰肽的内源活性；

(3) 通常可以进行修饰，不受任何空间或构象限制。

目前，C端标记方面的研究，相比于N端标记的研究少而又少。因为对肽链中羧酸侧链的羧基和C端上羧基的区分是具有挑战性的，因为羧酸侧链和 C 端羧酸盐的反应性非常相似，且对于全长蛋白质，酸性侧链比游离的 C 端要丰富得多。因此，特异性标记肽链的C端存在一些固有的化学挑战。

      此前，传统的C端标记方法包括将C端和醋酸酐亲核加成为恶唑啉酮或者利用缩肽酶和亲和分子在高pH下的加成反应等。然而，这些方法都需要比较苛刻的标记环境或具有一定的不可控性，进而导致了一些敏感肽段蛋白质的丢失以及后续质谱分析的困难。

首先，作者搭建A图装置，构建了B图反应体系。并对水相缓冲环境、催化剂、Michael受体和蛋白浓度等条件进行筛选优化。条件优化后，作者系统地对比了20种不同C末端氨基酸的标记产率，数据显示，20种肽中有13种转化率大于75%。含半胱氨酸的肽经反应不提供C端修饰产物，色氨酸产率低。推测是因为半胱氨酸末端会因为发生共轭加成影响产率，需要提前通过烷基化进行保护，而色氨酸的转化率则可能因为吲哚环和催化剂之间的电子转移而降低。

他们在Trypsin（胰蛋白酶）或GluC（胰高血糖素）消化后的BSA、酵母裂解液及人源细胞裂解液等复杂肽段上进行标记，证明标记有效且最高约为90%。

右图总结了15个独立实验产生的肽的分析，这些实验通过使用暴露不同肽C端AAs的端间裂解蛋白酶（AspN、lysN和LysargiNase）消化蛋白质样品通过串联质谱鉴定肽，并计算每个C末端修饰频率相对于其总观察频率的频率，以确定标记效率。证明在复杂样品中除组氨酸和蛋氨酸以外的氨基酸都具有较高的标记效率。

  基于C端标记在复杂肽段样品中的无偏好性，作者试图探究其在单分子蛋白质测序中的应用潜力。应用 C 端分化来固定肽以进行荧光测序，从而能够单分子确定荧光团衍生的内部酸性 AA 的序列位置。在单分子肽测序之前，血管紧张素的 C 端羧酸用 NB-PEG4-炔烃标记，其内部天冬氨酸用荧光团 Atto647N 标记。 (A) 说明了该过程中涉及的步骤：他们先将多肽C端标记上炔基，后用N端捕获策略将多肽固载，再通过酰胺偶联将荧光团加在谷氨酸上。释放肽之后，利用C端炔基将肽段固载到含叠氮的玻璃表面。

(B) 用 Atto647N 标记并固定在叠氮化物功能化载玻片上的血管紧张素的众多荧光标记单肽分子的代表性图像。 (C) 条形图显示了对这些标记和固定的血管紧张素分子进行的荧光测序实验的结果

对载玻片上的肽段进行Edman降解，通过检测每次降解后，多肽荧光强度的损失来确定标记的氨基酸在序列中的位置，最终将荧光反应的相对位置映射到参考数据库中以确定可能的蛋白。以此实现该方法在肽段荧光测序中的应用。

总结：据报道，光氧化还原催化的脱羧烷基化可以高效标记肽的 C 端羧酸残基，但这种方法的广泛应用尚未开发。为了将这种方法应用于“bottom-up”蛋白质组学领域和其他新兴的单分子蛋白质组学技术，该文章首先使用内源性血管紧张素作为目标底物优化了光催化过程，然后用 21 种合成肽测试了这种方法，并比较了标记效率。在此之后，该文章将脱羧方案应用于生物样品，并复杂混合物中的标记效率进行了预测。然后，该文章使用一组不同的蛋白酶在标记效率和偏差方面，生成和表征了生物样品中 C 端肽的随机池。这些结果均显示，在复杂溶液中的蛋白质残基的偏差最小，并且与使用纯化肽观察到的标记偏差密切对应。最后，该文章证明了脱羧烷基化在单分子蛋白质组学（即荧光测序）中的效用，通过使用化学方法将含炔烃的连接物附加到血管紧张素II的末端，然后使用正交化学方法，使用全内反射荧光显微镜（TIRF）对载玻片上的肽进行偶联和排序。该文章预计，这种分化反应将广泛用于蛋白质组学的研究。

文章来源：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschembio.1c00631

DIO：https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00631