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今天给大家介绍一篇Chemical Science上的文章，标题是“A proximity labeling method for protein–protein interactions on cell membrane”，通讯作者是加州大学戴维斯分校的Carlito B. Lebrilla。Carlito教授的主要研究方向是糖质谱组学。本文介绍了一种抗原抗体邻近标记(AAPL)方法，该方法可以绘制抗原相互作用位点以及抗体靶蛋白的相互作用位点。作为一种概念的证明，AAPL被证明使用钠/钾转运ATP酶(ATP1A1)和表皮生长因子受体2 (ERBB2)特异性抗体，用Fe(III)催化探针修饰。一旦与目标蛋白结合，Fe(III)诱导的催化氧化发生在抗原表位附近。然后使用氧化蛋白质组学分析来确定氧化程度，氧化位点在目标抗原，以及靠近目标抗原的互作蛋白。对每个蛋白质进行AAPL评分，得出氧化的特异性和互作蛋白质与目标抗原的相关程度。为了验证其效果，AAPL方法被用于绘制结肠癌细胞中钙粘附素(LI-Cadherin, CDH17)的互作网络。
细胞膜蛋白相互作用在信号转导和其他基本的生物学途径中是必不可少的。基于质谱的方法，如亲和纯化质谱（AL-MS）和交联质谱（XL-MS）近年来常被用作蛋白-蛋白相互作用的表征。利用过表达表位标记的诱饵蛋白（Bait），可以实现AL-MS的富集过程，进而进行MS鉴定，然而弱相互作用无法通过AL-MS来捕捉。XL-MS通过光或化学交联过程使交联探针与靶蛋白形成共价连接，能同时捕捉强或弱相互作用。 基于质谱的邻近标记结合蛋白质组学技术是另一种广泛用于探测蛋白质相互作用的方法。通过将目标蛋白与特定的酶或催化探针融合，将定位在相互作用位点附近的蛋白通过催化反应进行标记，然后用定量蛋白质组学进行表征。利用邻近标记蛋白质组学，可以识别出与目标物具有强或弱相互作用的蛋白。作者开发了抗原抗体邻近标记(AAPL)技术，通过邻近依赖氧化来绘制抗原的表位以及抗原的互作网络。作者提出了2种修饰方法即FeDBAb和FeAb，其中FeDBAb通过β-半乳糖苷酶水解抗体末端半乳糖苷键，再利用UDP-GalNAz与GalT-Y289L使抗体带上叠氮基，在与DBCO-FeBABE分子发生SPAAC反应后，抗体最终带有Fe(III)。FeAb即直接通过Br-FeBABE对抗体上半胱氨酸巯基发生卤素加成，最终FeBABE分子连接到抗体。（Figure 1） Figure 1 FeDBAb和FeAb的制备流程
Figure 2 APPL方法标记的原理
Figure 3 利用STRING和APPL对ATP1A1和ERBB2抗体的互作蛋白进行分析 Figure 4 利用GO对ATP1A1和ERBB2抗体的互作蛋白功能进行注释 Figure 5 A.利用STRING和APPL对CDH17的互作蛋白进行预测分析 B.使用GO分析注释CDH17互作蛋白的功能 作者分别使用了α-甘露糖苷酶抑制剂几夫碱（Kif）和唾液酸转移酶抑制剂3Fax-feracetylNeu5Ac，并发现Kif使CEAM1,ATLA3, 1A02, and VTNC的EPO值下降，提示这些蛋白与CDH17的互作降低，但STT3A和NOMO2的EPO并不下降。使用ST抑制剂时，也有类似的变化，即前几种蛋白EPO值均升高。通过糖蛋白组学分析发现前4种蛋白本底为高唾液酸化修饰，而后2种蛋白本底为高甘露糖型修饰，这解释了糖基化抑制剂处理导致的EPO程度不同的原因，同时也表明CDH17的糖基化水平对其蛋白互作有较大影响。 总之，作者提出了一种Fe(III)修饰抗体用于研究细胞表面蛋白-蛋白相互作用的方法，通过与其它数据库及打分方式的对比验证了方法特异性，并以CDH17作为验证，探究糖基化水平在蛋白互作中发挥的作用。 文章作者：MY DOI：10.1039/d1sc06898a 责任编辑：HBQ
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