Chemical Science|一种细胞表面蛋白-蛋白相互作用邻近标记方法

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今天给大家分享一篇2022年4月份发表在Chemical Science上的文章,文章通讯作者是来自美国加利福尼亚大学戴维斯分校的Carlito B. Lebrilla教授。

摘要:文章介绍了抗原-抗体邻近标记技术(AAPL),一种绘制抗原相互作用位点以及抗体靶向蛋白相互作用物的新方法。AAPL 使用钠/钾转运 ATP 酶 (ATP1A1) 和用 Fe(III) 催化探针修饰的表皮生长因子受体 2 (ERBB2) 特异性抗体进行验证。一旦与它们的靶蛋白结合,Fe(III) 诱导的催化氧化就会在抗原表位附近发生。然后使用氧化蛋白质组学分析来确定氧化程度、目标抗原内的氧化位点以及与目标抗原非常接近的相互作用蛋白质。为每种蛋白质生成 AAPL 评分,从而产生氧化的特异性和相互作用的蛋白质与靶抗原的接近程度。

研究背景:

开发的抗原-抗体邻近标记 (AAPL) 技术,通过邻近依赖性氧化来绘制靶向抗原的表位以及抗原的相互作用物。采用两种不同的方法来修饰抗原特异性靶向抗体,以产生具有催化功能的分子。在一种方法中,通过将末端半乳糖 (Gal) 更改为 N-叠氮乙酰半乳糖胺 (GalNAz) 来修饰抗体的 N 聚糖,然后与合成的可点击探针、二苯并环辛炔功能化溴乙酰氨基苄基 EDTA 铁 (III) 螯合物(DBCO- FeBABE) —— GalNAz 组。在另一种方法中,抗体通过其游离硫醇基团在半胱氨酸残基处直接用溴乙酰氨基苄基-EDTA (FeBABE) 分子的铁 (III) 螯合物进行修饰。

研究结果:

  • 确定最佳氧化条件

对人表皮生长因子受体 2 (ERBB2)、钠/钾转运 ATP酶 (ATP1A1) 和特异的单克隆抗体进行改造(图 1a)以引导 Fe(III)诱导对其靶抗原的催化氧化反应。使用了两种方法。在第一种方法中,抗体 Fc区聚糖通过添加 DBCO-FeBABE (FeDBAb) 进行共价修饰。第二种方法直接将 FeBABE 与抗体氨基酸骨架 (FeAb) 的半胱氨酸残基偶联。产生的每种抗原特异性氧化抗体探针都针对一种独特类型的细胞膜蛋白。抗体结合后,将过氧化氢 (H2O2) 添加到培养基中以在附着的抗体附近产生羟基自由基(图 1b)。膜蛋白在 H2O2处理后富集,并进行定量氧化蛋白质组学分析(图 1c)。通过计算氧化肽强度与每个肽的未修饰和修饰肽强度之和的比率来确定蛋白质上每个位点的氧化程度此外,通过计算每种蛋白质的总氧化肽强度与总肽强度总和的比率,获得每种蛋白质的蛋白质氧化程度 (EPO)。基于EPO确定最佳氧化条件。

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Fig. 1 Workflows of AAPL method

ATP1A1 和 ERBB2 上的氧化位点及其在蛋白质结构域中的位置显示了每种抗体的特异性(图 2a 和 b)。观察到在条件 M1-M6 和对照中,M5 条件下的ATP1A1 和 ERBB2(图 2c 和 d)及其各自的抗体产生了最高的 EPO通过检查用 ERBB2 特异性氧化抗体探针处理后 ATP1A1 的氧化来评估抗体交叉反应性。研究人员注意到在与 ERBB2 特异性氧化抗体孵育后,在 ATP1A1 上观察到三个氧化位点(图 2a);然而,在 M5 条件下,没有一个被高度氧化(图 2e),证明了 AAPL 方法的高特异性。

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Fig. 2 Oxidation of ATP1A1 and ERBB2 with different antibodies. (a and b) Oxidation sites of ATP1A1 with anti-ATP1A1 antibody and anti-ERBB2 antibody are labeled on the domain diagram of ATP1A1.

  • 建立目标抗原的 AAPL 相互作用标准

定量氧化蛋白质组学分析用于鉴定与目标抗原非常接近的蛋白质,将其称为抗原-抗体接近标记 (AAPL)。对于氧化蛋白质组学分析,计算总蛋白质氧化的两个值:氧化蛋白质的光谱计数和蛋白质氧化程度(EPO)通过离子丰度测量。光谱计数和离子丰度的结合提供了一种在蛋白质特异性水平上测量蛋白质氧化的更一致的方法。在 AAPL 中,相互作用的程度是根据使用每种氧化蛋白质及其 EPO 的光谱计数计算的 AAPL 评分来评估的。AAPL 评分大于 0 的蛋白质被认为相对于对照更倾向于被氧化。该方法用于识别 ATP1A1 和 ERBB2 相互作用物,在 M5 条件下产生了 40 多种 AAPL 评分超过 0 阈值的蛋白质。
AAPL 方法的特异性还通过比较在 ATP1A1 和 ERBB2 AAPL 网络中常见的指定相互作用蛋白类型进行了研究。还生成了一个合并的相互作用网络。在两个相互作用网络中总共发现了 5 种蛋白质,包括 GAPDH、TFRC、VDAC1、ATP2A2 和ATP1A1。根据前述的计算标准VDAC1 被确定为 ATP1A1 和ERBB2 的 AAPL 相互作用物,这与观察到在ATP1A1 和 ERBB2 的 AAPL 条件下蛋白质被越来越多地氧化的观察结果相对应。这些观察结果证明了 AAPL 方法对靶向抗原及其相互作用物的特异性。

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Fig. 4 (a) and (b) Interaction maps of ATP1A1 and ERBB2.

  • AAPL 在 Caco-2 细胞系中对 LI-cadherin 的应用

蛋白质 LI-cadherin 是在肝脏和肠道中发现的钙粘蛋白家族的成员。该蛋白质参与肝脏和肠道的形态组织。虽然该蛋白质也属于由七个钙粘蛋白结构域组成的钙粘蛋白超家族,但之前的几项研究表明,LI-钙粘蛋白介导的细胞聚集不依赖于细胞质相互作用。为了鉴定 LIcadherin 的原位相互作用物,将 AAPL 方法应用于未分化和分化的 Caco-2 细胞系。使用 AAPL 方法,几乎没有发现 LI-cadherin 在未分化的 Caco-2 细胞中发生氧化,但在肠道细胞中发现了高度氧化的 LI-cadherin。这可能是由于未分化的 Caco-2 细胞中 LIcadherin 的表达水平较低,导致修饰抗体的结合较少,这进一步导致不足以进行氧化鉴定的氧化蛋白质的量较低。这一观察结果也证明了 AAPL 方法的特殊性。

结论

抗原-抗体邻近标记(AAPL)为确定靶向抗原的相互作用提供了一种新方法。对用 DBCO-FeBABE 修饰抗体的方法进行了深入的研究探索,并成功地用于标记细胞表面膜蛋白及其相互作用环境。


原文链接:https://doi.org/10.1039/D1SC06898A

  • DOIhttps://doi.org/10.1039/D1SC06898

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