推荐一篇Nature Chemical Biology的文章，Activity-based RNA-modifying enzyme probing reveals DUS3L-mediated dihydrouridylation。通讯作者是普林斯顿大学化学系的Ralph E. Kleiner，他们组主要专注于细胞内RNA修饰及相关的功能解码。
表观转录组中RNA的修饰可以调节RNA活性从而影响细胞的生理功能，如人们对m6A的相关研究和理解已经迅速成熟。相比之下，人们对其他RNA修饰的研究就进展相对较慢。本文即发展了一种RNA介导的、活性为基础的蛋白质组鉴定策略RNABPP，用来研究人类活细胞中RNA修饰的酶，拓展人们对RNA修饰及相关酶的认知。
作者将研究对象集中在5-甲基胞苷(m5C) 和 5-甲基尿苷 (m5U) 甲基转移酶上，因此选择用5-氟胞嘧啶核苷进行代谢标记。5-氟胞嘧啶核苷（5-FCyd）是胞嘧啶核苷的类似物，且在细胞内会转化为5-氟尿嘧啶核苷（5-FUrd），也就是尿嘧啶核苷的类似物。5-FCyd及5-FUrd均能有效地插入到细胞内的RNA中，并且与5-甲基胞苷(m5C) 或5-甲基尿苷 (m5U) 甲基转移酶形成稳定的共价加合产物。
作者用5-FCyd处理活细胞，在代谢标记中，含有5-FCyd的RNA会与对应的核苷甲基转移酶形成共价交联，随后，作者在变性条件下通过多聚胸腺嘧啶[oligo(dT)]富集细胞内的mRNA，并对富集获得的共价作用的蛋白进行鉴定。为了能够获取置信度更高的核苷甲基转移酶，作者引入了定量的蛋白质组技术，对细胞进行有或无5-FCyd的处理，获取三个独立的生物学重复，六个样品用TMT进行标记和后续的定量分析。最终获得了9个置信度较高的靶蛋白，其中4个是已知或预测的5-甲基胞苷转移酶。随后，作者还通过这些靶蛋白的敲除体系研究了它们对细胞内总的RNA或mRNA上胞苷或鸟苷甲基化的重要性。
靶点蛋白中DUS3L引起了作者的注意，因为DUS3L属于二氢尿嘧啶核苷脱氢酶家族，然而，在此之前，在人类的mRNA上尚无二氢尿嘧啶核苷（DHU）的报道。为了进一步验证这一结果，作者通过western blot确证了DUS3L-RNA共价复合物的存在并研究其交联的机理，明确C396位催化功能的半胱氨酸在其中发挥关键作用。接下来，作者通过DUS3L的敲除研究了它对细胞内各类RNA上DHU的影响；还通过DUS3L的免疫共沉淀获取DUS3L对应的相互作用的RNA，随后分析其相互作用RNA的组成成分和序列偏好性。最后，作者还研究发现DUS3L 的基因敲除会降低蛋白质的翻译率并使得细胞增殖受损。
总之，本工作将RNA类似物的代谢标记与活性为基础的蛋白标记与全局性检测结合在一起，提供了一种分析RNA修饰的通用策略，为RNA修饰的表观转录组学的研究提供了新的思路。
本文作者：CXM
责任编辑：LDY
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41589-021-00874-8
原文引用：DOI: 10.1038/s41589-021-00874-8
目前评论：