推荐一篇发表在JACS上的文章，文章的通讯作者是来自俄勒冈州立大学的Ryan A. Mehl教授，他们课题组主要致力于利用遗传密码扩展技术将非天然氨基酸（ncAAs）特异地整合到蛋白质中，从而能够开发新的工具用于生物体系的研究之中。

      在真核系统中，快速而又高效的蛋白质正交标记反应，是细胞生物学研究中非常重要的工具。而对于目前来说，由于标记反应的反应速率限制，使得我们能够监测的生物学过程受到了限制。环张力的炔基和四嗪之间的反应速率虽然可以达到107 M-1S-1，但是在活细胞中优化这些官能团编码的同时如何有效地避免功能化基团的脱靶作用还是一个巨大的挑战。近些年来，由赖氨酸衍生的带有双环壬炔（BCNK）和反式环辛炔(TCOK)两种非天然氨基酸与四嗪衍生物之间的标记反应已经被广泛应用于真核细胞中的生物学研究中，例如活体成像，功能探测，超高分辨率显微镜等等。但由于活细胞内需要反应性和生物相容性的兼容，所以这两种非天然氨基酸所能实现的反应速率只能达到2*104 M-1S-1。所以本篇文章中，作者首先考虑反过来将编码四嗪的氨基酸作为非天然氨基酸编码(Tet-v2.0)引入到蛋白质中，结合反式环辛烯从而发展了一种高效快速且副反应非常低的标记策略。

    作者使用了生成基于真核生物正交系统最常用的巴氏甲烷八叠球菌的吡咯基-tRNA合成酶PylRS/tRNACUA 对为起点完成Tet-v2.0的引入，但是发现107个RS活性位点变体都无法有效识别。进一步对晶体结构进行分析发现，四嗪环，β折叠片骨架以及侧链之间存在重叠，所以后续为了避免大量的活性位点的改造，作者调整了将四嗪从苯环的对位调至间位，从而使四嗪结构可以深入到结合口袋中，作者进一步合成了甲基，乙基，异丙基，丁基衍生的含有四嗪结构的非天然氨基酸(Tet-v3.0)，筛选得到了R2-74和R2-84两对tTNA/RS，并利用这两对tTNA/RS实现了在GFP的第150位上插入以上四种非天然氨基酸。通过进一步测定了，作者发现四种插入了非天然氨基酸的GFP对应的反应速率大概都在80000M-1S-1，且丁基衍生的非天然氨基酸可以在最低浓度的条件下有最高的表达水平。进一步作者将体系引入到真核细胞HEK293T的定点插入中，通过进一步利用TAMRA-sTCO标记，验证了反应就有高选择性，通过直接与sTCO反应，利用质谱检测反应前后的体系证明反应转化完全。以上实验说明丁基衍生的非天然氨基酸可以高效稳定地插入到真核系统中，并且可以与sTCO衍生的探针发生高效快速定量的偶联反应。

    由于高反应速率降低了标记反应所使用的浓度，所以当标记试剂浓度低于蛋白浓度时，可以用于活细胞中蛋白标记的亚化学计量分析。所以作者后续利用PEG链连接了两个sTCO小分子，这个小分子进入细胞之后可以迅速引发插入丁基衍生非天然氨基酸蛋白的二聚，当小分子量不足时，体系内只会存在二聚体，当小分子浓度过高时只有一段反应的产物生成，作者进一步通过浓度递增的小分子标记，Tet2.0淬灭,SDS-PAGE分析条带的迁移率对该反应在真核细胞中能够进行亚化学计量的蛋白质标记进行了验证。

      总之，本篇文章发展了一种迄今为止最快速的副反应低的生物正交反应用于真核细胞中位点特异性蛋白标记的，为后续标记和成像等研究提供了强大的工具。

本文作者：YF

文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.9b11520

文章引用：DOI: 10.1021/jacs.9b11520