2021年8月，英国皇家化学会旗舰刊《Chemical Science》刊发了北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室马明研究团队的最新工作，该文章讲述了作者通过对一株海洋链霉菌的生物合成基因进行分析，异源表达从中获得了一个Ⅱ型套索肽产物，通过对核心肽进行单突变获得了一系列结构相似的套索肽衍生物，进行双突变获得了与目前已知四类套索肽类型不同的新颖套索肽，同时通过位点选择性化学修饰获得了结构更加多样化的套索肽衍生物。

套索肽是一类独特的RiPPs，它们是一个特殊的C端螺纹折叠，其中C端氨基酸残基穿过N端大内酰胺环的结构类似于“套索”。正因为这种特殊的结构，套索肽具有良好的耐热，不易变以及耐降解的特性。正因为这些特性，目前套索肽被认为是具有理想药代动力学性质的潜在药用分子。

作者在一株在海洋链霉菌sp. PKU-MA01240的基因簇中发现了套索肽的生物合成基因簇，经过序列分析推测它可能是第二类套索肽，同时核心肽包裹15个氨基酸残基，通过异源表达获得了一个Ⅱ型套索肽stlassin 1，产量高达10mg/L。作者对核心肽上的15个氨基酸残基进行点突变，发现对不同位置的氨基酸进行突变会对生物合成具有不同的影响。如：对于1号位和7号位的突变，其套索肽衍生物的产量明显远远低于stlassin 1，对于9号位的突变，将其突变成带有芳香侧链的氨基酸的产量明显高于将其突变成小氨基酸的产量，可能是在这个位置的芳香侧链可能以某种方式支持这些肽的翻译后修饰，或者说能够避免套索肽在排出细胞前被解旋。对于13号位的突变没有产生新的化合物，这是因为13号位的甘氨酸位于大内酰胺环的中间，所有带有侧链的氨基酸残基在那个位置都有可能会阻碍预折叠，所以在此处进行突变没有产生衍生物。对于14和15号位的突变，将其突变成带有芳香侧链的氨基酸的产量明显高于将其突变成小氨基酸的产量，这是因为14和15号位是发挥“空间锁”的主要力量，因此在此处具有芳香环侧链的氨基酸产量更高。

图1 核心肽单突变的stlassin衍生物与stlassin的相对产量

图2  stlassin(1)及其衍生物的NMR溶液结构

作者想要通过双突变引入两个半胱氨酸，在大内酰胺环和C端环之间生成一个二硫键，生成一种区别于目前已知的四类套索肽的一类新的套索肽，即又含有二硫键，又在C端末端含有大氨基酸形成空间锁。作者找到了四对氨基酸残基，1号亮氨酸/11号丙氨酸，2号缬氨酸/11号丙氨酸，2号缬氨酸/12号脯氨酸，7号丙氨酸/12号脯氨酸。想要通过对它们进行突变来获得目标产物。双突变V2C/A11C和V3C/P12C产生了衍生物18和19。作者对化合物18的NMR进行了分析，发现它与化合物1一样都是right-handedlasso folds。并且和化合物1一样具有很好的热稳定性和蛋白水解稳定性。

图3  HPLC分析双突变菌株产物

上述的衍生物都是基于对于核心肽的突变或者基于翻译后蛋白StlaB1/B2/C的底物宽泛性。显然，因为缺乏除了StlaB1/B2/C以外的生物合成基因导致了stlassin骨架的肽单调性。最近的一些研究表明，在温和的条件下，不同肽的酪氨酸和半胱氨酸残基可以高效且选择性的进行糖基化和芳基化。基于此作者通过对stlassin F15Y (16)进行糖基化生成了化合物20。作者通过观察对比选择将四号位的异亮氨酸突变成半胱氨酸，理由如下1)I4A的产量高2）它的位置远离C端环区域的位置可以避免潜在的空间位阻效应。因此作者通过单突变获得了含有半胱氨酸残基的stlassin I4C (21)。作者对stlassin I4C (21)进行糖基化生成了化合物22，在反应的同时也生成了二聚产物化合物23，为了提高化合物22的产量，作者在反应中加入了TCEP，抑制了二硫键的形成。对stlassin I4C (21)进行芳基化生成了化合物24。

Dha残基可以进行很多修饰，例如磷酸化，糖基化，甲基化，乙酰化，脂化。因此作者想要通过引入Dha残基来获得结构多样化的套索肽。因此作者通过对化合物21进行bis-alkylation–elimination reaction反应将4号位的半胱氨酸残基转变成Dha残基，从而得到了化合物25。将化合物25和巯基乙醇和N-乙酰基半胱胺进行迈克尔加成反应。获得了化合物26a，26b和27a，27b。

图4  stlassins18–27的生成

套索肽具有多种生物活性，例如抗菌作用。作者对化合物1进行了生物活性测定，发现化合物1对几种革兰氏阳性和阴性菌株没有抑菌活性，对多种人类肿瘤细胞也没有明显的细胞毒性。但是作者在基于生物素-链霉亲和素的酶联免疫吸附试验(ELISA)的实验中发现1对LPS与TLR4的结合具有拮抗活性。已知LPS的结合促进TLR4-MD-2复合物的二聚，随后招募几个信号转接分子并启动一系列信号级联反应，导致炎症介质的释放。随后作者对化合物2–12,14–16,18–21, 24都进行了LPS拮抗活性测定。发现stlassins I4A (4)，I4C (21)，I4C- Ⅲ (24)， F15Y(16)和F15Y-Ⅰ(20)与stlassin 1具有相似的拮抗活性。

图5  stlassins对LPS与TLR4结合的拮抗活性

综上所述，作者通过对核心肽进行点突变，分析了氨基酸残基对于stlassin形成的影响。通过对核心肽进行双突变获得了区别于目前已知的四类套索肽之外的新型套索肽。通过进行位点选择性性化学修饰获得了结构更加多样化的stlassin型化合物。进行了生物活性测定发现对Ile4和Phe15进行突变或者位点修饰的stlassin衍生物显示出对LPS与TLR4结合的拮抗活性。这一系列的工作为建立一个独特的套索肽库奠定了基础。将为进一步以生物活性为导向的结构优化和抗炎剂开发提供支持。