今天分享一篇发表在Nat Chem Biol上的文章：Organelle membrane-specific chemical labeling and dynamic imaging in living cells，通讯作者是来自日本京都大学工学研究科合成化学与生物化学系的浜地格教授，主要从事细胞有机化学、以蛋白质为中心的生物化学的研究。

1. OCR的设计，合成

设计了一种内质网-高尔基OCR，以下称为化合物1（Rhodol-DBCO），它由既充当内质网-高尔基体定位剂又充当荧光报告分子（Rhodol）和作为炔烃的二苯并环辛炔（DBCO）组成（图1b）。将HeLa细胞在含有化合物1（100 nM）的培养基中于37°C孵育15分钟，在内质网，高尔基体和内质网–高尔基体中间区室中产生1的强荧光（图1c）。

图1 成像原理和OCR1的结构及成像

2. 活细胞中的细胞器选择性脂质标记

 为了进行CPL标记，随后将N₃-Cho处理的HeLa细胞与化合物1（100 nM）。发现SPAAC反应在15分钟内完成。然后，从细胞中提取脂质级分并通过薄层色谱法（TLC）进行分析。在从N₃-Cho处理的细胞中提取的样品中检测到强荧光点，而没有叠氮的胆碱对照样品中处理仅产生微弱的荧光斑点，该荧光斑点来自化合物1标记产物。主要荧光点的LC-MS/MS成功表征了N₃-Cho和化合物1处理细胞的产物。

如图1d所示，在N₃-Cho处理的细胞中，内质网-高尔基体中主要观察到1-PC的荧光，而未处理的细胞中未检测到荧光。标记后，固定细胞的叠层成像显示，1-PC的荧光与内质网-高尔基体标记在细胞中的任何位置（垂直方向）都很好地共定位（图1e）。

图2. OCR2的结构及成像

        试图将该方法扩展为标记线粒体PC。阳离子罗丹明染料是已知的根据线粒体膜电位自发定位于线粒体。因此，使用四乙基罗丹明作为线粒体可定位的染料，并合成了线粒体定位的点击试剂OCR2（图2a）。化合物2显示出高度特异性的线粒体定位性，TLC分析以及LC-MS/MS，2-PC显示该探针可以选择性标记PC。未反应的化合物2可以通过洗涤从细胞中去除，这使得可以专门观察N₃-Cho处理的细胞的线粒体中的2-PC（图2b）。为了可视化线粒体膜结构，进行了基于晶格结构超分辨率照明显微镜（SIM）的成像。SIM的快速成像速度，使能够捕捉到活细胞超分辨率的视频，并明确表明2-PC位于线粒体的外膜（OM）和内膜（IM）中，但不在线粒体基质中（图2c-f）。

        通过对内质网-高尔基体和线粒体的特殊标记可以对活细胞中的细胞器磷脂酰胆碱进行多色成像。如图2g所示，N₃-CPLs在内质网-高尔基体，线粒体和细胞质膜通过用化合物1，2以及Alexa Fluor 647 DBCO进行选择性地标记以在活细胞可视化，由于每个荧光探针有不同的波长，这些数据清楚地突出了该方法的细胞器膜正交性。

3. 标记PC的细胞器间移位成像

       通过活细胞成像监测了标记的PC从内质网-高尔基体或线粒体向其他细胞内细胞器的运输。将细胞在培养基中孵育约6小时。如图3a所示，荧光信号1-PC是专门在内质网-高尔基体在初始时间点观察到的，Pearson相关系数（PCC）1-PC和内质网-高尔基体标记信号较高（〜0.84）。但是，在330分钟后，在内质网-高尔基体中1-PC的荧光强度下降（图3e），同时，其他细胞器如溶酶体，线粒体和细胞质膜出现荧光（图3b-d）。TLC分析证实1-PC的细胞内量在实验时间范围内（〜6 h）没有变化，因此很有可能基于标记的PC本身。这些结果清楚地表明标记的PC已从内质网-高尔基体转移到其他细胞器的膜上。

图3 标记PC的细胞器间移位成像

       为了定量评估内质网–高尔基体中PC的流出动力学，进行了延时成像。在内质网-高尔基体1-PC后标记孵育过程中降低，如图3e，衰变曲线表明从内质网-高尔基体中PC流出的时间为90分钟。在此报告了在活细胞条件下实时成像的基础上，对从内质网-高尔基体到其他细胞器的PC外排的定量分析。用细胞器标记物进行的共定位分析表明，标记后约1 h，1-PC到达线粒体，而向细胞质膜和溶酶体的易位发生的速度更慢（分别在1-2和4-6 h；图3b-d）。总之，表明可以对PC进行荧光成像，并可以实时跟踪从一个特定细胞器膜到另一个特定细胞器膜的动态细胞间分布。

4. 内质网脂质转运至自噬体膜的直接成像

       自噬体（APs）是由自噬诱导的囊泡，参与细胞内组分的整体降解和再循环。虽然近几十年来人们对自噬体的生理作用的了解大大增加，但自噬体膜的起源仍不清楚。由于没有合适的方法能够选择性地可视化细胞器膜脂，因此这些假设大部分已使用基于蛋白质的荧光探针而不是膜脂本身进行了验证。因此，该方法使能够直接在内质网–高尔基体或线粒体中标记PC，并通过活细胞成像专门监测PC的行为。寻求获得直接证据证明。

       将表达微管相关蛋白1轻链3 beta（LC3B）（一种典型的自噬体标志物）的HeLa细胞用化合物1进行标记，然后在平衡盐溶液中培养以诱导自噬体形成（图4a）。短暂孵育（0-30分钟）后，观察到少量用LC3B-RFP可视化的AP与1-PC的荧光信号共定位最小（图4a-c）。3小时后，细胞积累了血清饥饿诱导的自噬体，其点与1-PC的荧光点很好地融合（图4a-c）。超分辨率显微镜图像清楚地表明，在自噬体膜中检测到1-PC为圆形（图4b）。这清楚地表明，内质网-高尔基体中的1-PC已转移到自噬体膜上。饥饿时，包括1-PC的自噬体囊泡数量呈时间依赖性增加（图4c）。

图4 内质网脂质转运至自噬体膜的直接成像

根据目前的膜转运模型，提出了将1-PC从内质网-高尔基体运输到自噬体的两种可能途径：（1）脂质从内质网-高尔基体中分离出来直接提供给自噬体。（2）脂质从内质网-高尔基体中转移到另一个细胞器的膜中，然后转移到自噬体膜中。为了测试这些可能性，试图通过实时成像捕获经化合物1处理的细胞中AP形成的初始阶段。使用的mCherry融合自噬相关5（ATG5），作为可靠的吞噬标记物。活细胞中ATG5的斑点与1-PC的斑点具有很好的共定位性，更重要的是，还观察到，产生一个ATG5后，1-PC的荧光随后聚集在内质网结构特征上的同一点，并且ATG5监测的囊泡显示出与1-PC监测的相同轨迹（图4d，e），表明1-PC直接从内质网转移到自噬体膜。因此，成像数据提供了强有力的证据表明，自噬体膜起源于内质网。

       总而言之，作者描述了一种用于目标细胞器中磷脂酰胆碱的选择性标记和荧光成像的技术。该技术基于将叠氮基团代谢结合到含胆碱的磷脂中，然后进行生物正交反应，该反应能够对活细胞中的细胞间脂质转运进行可视化和定量分析。更重要的是，通过活细胞成像，获得了自噬体膜起源于内质网的直接证据。