分享一篇发表在Nat. Chem. Biol.上的文章，文章的通讯作者是哥伦比亚大学化学系的Ruben L. Gonzalez Jr.教授，其主要从事生物分子组装体的研究。
生化和生物物理特异性标记的现有方法会显著干扰多组分生物分子复合物（MBC）的组装和功能。为了克服这些限制，作者开发了一种通用的多重方法，其中作者将非天然氨基酸（ncAA）基因组编码为目标MBC内多个结构相关的单个位点；选择含有ncAA的MBC变体，使其像野生型MBC一样组装和运行。作者已经使用这种方法来生成独特的单分子荧光共振能量转移（smFRET）信号，报告了核糖体的结构动力学。
为了对核糖体进行位点特异性标记，作者针对9个核糖体蛋白基因的13个不同位置进行了定位，从而使这些位置上的荧光团能够实现对三个核糖体结构重排的smFRET研究（这些重排是先前smFRET难以捕获或难以解释的）：（1）30S亚基的“头部”结构域相对于“身体”结构域（即“头部旋转”，HS）的亚基内部旋转，（2）翻译核糖体沿其mRNA模板移动（即'mRNA易位'，MT），（3）较大的或50S的核糖体亚基相对于30S的亚基旋转（即'亚基间旋转'），IR）。为了确定可报告HS和MT的候选标记位置，作者使用了先前报道的核糖体复合物的高分辨率X射线晶体学结构来建模HS和MT，并通过计算确定了引入标记替代的氨基酸残基对，该氨基酸残基对由30S亚基的头部结构域和身体结构域的各一个残基组成，预计这将导致易于检测到不旋转和旋转构型FRET效率的变化。从最初得到的氨基酸对中，作者筛选出了人工肉眼检查确定为表面可及的结果。最后，对所考虑的配对中的残基进行了系统发育分析的筛选。作者使用了类似的办法得到了研究MT的氨基酸对。为了确定可以报告IR的候选标记位置，作者使用了过去研究中确定的位点。
为了在所选的13个位置特异性地标记大肠杆菌核糖体，作者决定使用工程化的UAG终止密码子对ncAA p-AzF进行基因组编码。为了使p-AzF基因编码不受RF1介导的翻译终止的潜在竞争，作者选择使用先前开发的C321Δa大肠杆菌株，使用多重寡聚核苷酸池对大肠杆菌基因组中核糖体蛋白基因的13个突变标记位点进行6到8轮λRed介导的MGE。在1 mM p-AzF存在下进行所有轮MGE，以便在将突变引入基因组后立即将ncAA并入MBC中。（MGE保留了靶基因的基因组背景，从而确保MBC在体内的正确组装。而且，MGE要求每个突变菌株与所有其他突变菌株和野生型菌株竞争，从而选择具有近乎野生型活性的装配和功能的突变MBC。）作者接着使用多重等位基因特异性克隆（MASC）–PCR筛选得到的细胞群体，一旦确定携带每个突变的菌株，都经过Sanger测序进一步证实。利用这种方法，作者能够分离出10个菌株，其中每个菌株在作者最初针对的13个位置中的10个位置上携带一个或两个标签突变，其余3个突变具有显著的适应性缺陷。多轮MGE中，作者的方法选择功能上允许突变的MBC。同时，作者使用大肠杆菌的EcNR2菌株重复了实验证明了该方法的普适性。
接着，作者从三个双突变菌株（HS1，HS2和IR1）和一个单突变株（MT1）中纯化了核糖体，然后将亚基用DBCO衍生的Cy3 FRET供体和/或Cy5 FRET受体荧光团标记。通过与基因不带TAG的核糖体蛋白在存在p-AzF的情况下对比，使用SDS-PAGE结合荧光凝胶扫描仪证明了p-AzF掺入突变株的核糖体蛋白中的位点特异性。
最后，为证明作者的标记核糖体在smFRET研究中的应用，作者使用宽视野全内反射荧光（TIRF）显微镜进行了smFRET实验。在这些实验中，上述Cy3-和/或Cy5标记的核糖体和任何所需的tRNAs和/或翻译因子被用于在5′-生物素化的mRNA上组装或延伸核糖体。然后使用生物素-链霉亲和素-生物素桥将所得络合物系在PEG/生物素-PEG衍生石英微流控池的表面。作者对含有HS1、MT1和IR1 smFRET信号的配合物进行成像，观察到Cy3和Cy5荧光强度随时间变化的轨迹，这些轨迹显示出Cy3和Cy5荧光强度变化，然后对Cy3和Cy5荧光团进行单步光漂白，证明该配合物包含单一Cy3和Cy5荧光团的位置，以便产生可检测的FRET效率。通过FRET效率与时间轨迹，作者使用得到的七个smFRET信号中的四个报告了核糖体的HS、MT和IR结构动力学的变化。总之，作者开发了一种通用的方法，可以实现先前smFRET无法研究的翻译过程，报告MBC的动力学变化。
本文作者：Gu ZH
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-020-0599-5
原文引用：10.1038/s41589-020-0599-5
目前评论：