目前共价抑制剂开发大多是以半胱氨酸为靶标设计合成的，但配体结合位点附近半胱氨酸的含量较低，使此策略受到限制。而赖氨酸作为亲核性氨基酸通常位于功能位点和配体结合位点附近，这一优势使其成为共价抑制剂新靶标。但是以赖氨酸为靶标目前仍有两大挑战，其一是，对靶标的选择性有待探索，其二是，很少有共价抑制剂能参与动物体内激酶催化赖氨酸反应。美国加州大学旧金山分校Jack Taunton课题组针对以上问题，给出了新思路。作者在其前期工作的基础上将苯甲醛片段连接到激酶结合分子骨架上得到了可逆共价靶向赖氨酸分子探针，并且使用定量化学蛋白质组学方法，对此探针在人类细胞和小鼠激酶靶标上的停留时间进行了评估，成功揭示了此新型探针因在靶标上停留时间不同产生的激酶选择性。近日，该项研究工作发表在Nature Chemical Biology期刊上(Nat Chem Biol 2022,18(9),934-941)【1】
一、醛基激酶探针的设计和评价
水杨醛共价弹头最早被应用在共价药物Voxelotor上，此药物已被FDA批准用于治疗镰刀状细胞疾病。水杨醛上的醛基能够与赖氨酸的末端胺基发生可逆反应形成亚胺，并通过邻位酚羟基与亚胺上的N原子形成分子内氢键，进一步稳定与增强其与赖氨酸的相互作用。Jack Taunton团队在其课题组之前开发的靶向赖氨酸广谱激酶探针XO44的基础上，用醛基替换原先的黄酰氟，发展出带有苯甲醛的探针1，带有水杨醛可逆共价探针3（YTP-2137）和探针4，四个探针分子结构如图1所示。
图1. 探针XO44、探针1、探针3、探针4分子结构
首先该研究团队利用Jurkat细胞器对以上化合物进行了靶标标记能力评价。研究发现单独的醛基探针比水杨醛探针的标记能力弱。当裂解缓冲液中不加氰化硼氢化钠时，TAMRA标记蛋白的检测就消失了，此现象与探针1与赖氨酸形成可逆的亚胺共价化合物的推测一致。在冲洗实验中，探针1处理的细胞荧光标记强度迅速下降，(衰减半衰期, t1/2 ≪10 min),这进一步证实了探针1的可逆性。而探针3，4相较于探针1，2有较强的靶标驻留能力，这恰好说明了邻位羟基对亚胺有稳定作用。
二、探针所识别的靶标蛋白信息解析及探针在不同靶标蛋白上停留时间研究
为了获取探针识别的靶标蛋白信息和估计探针在不同靶标蛋白上的停留时间，研究人员使用亲和富集和LC-MS/MS检测的方法代替SDS-PAGE，用基于活性的蛋白质组分析（Activity-based protein profiling，ABPP）方法对新型探针的可行性和时间依赖性进行评估。结果发现，探针1,3,4成功富集了64个不同激酶。接着用基于无标记定量（label-free quantitation,LFQ）的方法，研究者发现新型探针能够优先从活细胞中富集分离出激酶蛋白。随后，研究人员通过比较在洗涤情况下激酶信号强度的半衰期来评估探针3在细胞中不同激酶上的停留时间。结果显示，探针3仅在AURKA、AURKB、MAST3和SGK3四种激酶上的驻留时间较长，半衰期均接近或超过6h，这提示此类化合物具有较好的时间依赖选择性。为了进一步验证化学蛋白组学的数据，作者在细胞上着重研究探针3与靶标AURKA （t1/2>>6h）,Src (t1/2<1h)之间的相互作用。细胞学实验与上述组学实验结果一致，同样说明探针3与AURKA的结合是准不可逆的，相比之下其与Src的结合时间很短（<30min）。
三、AURKA和探针 3的共晶结构解析
作者希望从分子层面了解探针3与AURKA的准不可逆结合，于是在没有硼氢化物还原的情况下获得了共晶，并测定了其结构。氨基吡唑与AURKA铰链区形成三个氢键，K162的ε-胺和探针3的醛之间形成亚胺，赖氨酸侧链相对于水杨醛的取向允许亚胺和邻苯酚之间形成分子内氢键，这大大增强了水解稳定性，另外富含甘氨酸的loop区以及激活区的N端区很好地将亚胺与水隔绝开，使其免受溶剂影响变得稳定。共晶结构如图2所示。
图2 AURKA与水杨醛结合的共晶结构 a),水杨醛3与AURKA的催化赖氨酸形成亚胺键b), AURKA与探针3结合的表面渲染，突出显示富含甘氨酸的环（红色，右上）和激活段（红色，右下），这两者都起到保护水杨醛亚胺免受水影响的作用（绿色的是亚胺碳）。
四、探针3在小鼠体内激酶占有率的定量分析及应用
研究人员完成探针在活细胞中实验后，紧接着进行了动物实验。他们给小鼠注射探针3后分别收集给药后1小时、3小时和7小时的血浆和脾脏，以量化探针3浓度和不同激酶的占有率。实验流程如图3所示。动物实验同样证实探针3与大多数激酶结合后会快速解离。而少数三种激酶AURKA、AURKB和SGK3表现出了不同的药效学模式，能够与探针3有较长时间的持续结合，这再次印证此类化合物具有较好的时间依赖选择性。
图 3 水杨醛探针3在小鼠体内激酶占用率的定量研究。
随后，研究人员在小鼠身上进行了竞争性标记实验，使用探针3与PF-06873600（一种Cdk2,Cdk4,Cdk6抑制剂）进行竞争。化学蛋白质组学分析显示，比起对照组，PF-06873600处理的小鼠Cdk2和Cdk17的富集显著降低，说明PF-06873600能够与Cdk2和Cdk17激酶结合，使探针3无法将其偶联富集分离。这体现出利用探针3在动物中进行竞争性激酶结合实验的可行性，结果如图4所示。
图4 水杨醛探针3揭示PF-06873600分子在小鼠体内进行靶向结合
小结
Jack Taunton研究团队提出了基于停留时间依赖的可逆共价小分子探针选择性的新概念，证明了可逆共价靶向赖氨酸的分子探针可以在体内实现持续的激酶参与，同时展示了水杨醛分子探针对于活细胞与小鼠体内激酶靶标基于不同停留时间的选择性。水杨醛分子探针因其出色的停留时间，及其较好的靶标选择性为可逆共价探针与抑制剂的研究与开发提供了新的研究思路与方向。
参考文献
【1】Yang, T., Cuesta, A., Wan, X., Craven, G. B., Hirakawa, B., Khamphavong, P., May, J. R., Kath, J. C., Lapek, J. D., Jr, Niessen, S., Burlingame, A. L., Carelli, J. D., 和Taunton, J*. Reversible lysine-targeted probes reveal residence time-based kinase selectivity. Nat. Chem. Biol, 2022,18(9), 934–941.
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