分享一篇2022年发表在《Nature Chemical Biology》上的文章：Cell-type-specific labeling and profiling of glycans in living mice，文章的通讯作者是北京大学的陈兴教授。陈兴教授课题组的研究兴趣集中于化学糖生物学，主要研究内容包括活细胞和活体中聚糖的化学标记、成像及组学分析，脑部糖基化的生理及病理功能，糖基化在蛋白质-RNA相互作用中的功能以及生物大分子（糖、蛋白、核酸）的代谢标记方法开发等。

糖链代谢标记（metabolic glycan labeling，MGL）技术是将非天然糖（如叠氮糖或炔基糖）经过体内代谢循环并入到细胞表面的糖链上，然后与功能探针（如荧光基团和亲和标签）发生生物正交偶联反应，是一种实现活细胞中糖链标记的强有力手段。为了使MGL的细胞具有选择性，前期研究中陈兴教授团队开发了脂质体辅助的生物正交报告策略，该策略中叠氮糖被包裹在靶向配体的脂质体中，可以选择性标记能过表达靶向受体的细胞[1,2,3]；另外，Bertozzi教授团队等还开发了具有保护基的“笼状”叠氮糖，可选择性标记能过表达相应裂解酶的癌细胞[4,5,6]。然而，这两种方法的应用受到细胞类型的限制，且由于受体或酶也不仅仅表达于靶细胞，还会在其它细胞中表达从而造成假阳性标记。因此，作者就设想能通过一个非天然糖与外源表达的酶的正交配对来实现专一化的细胞选择性标记。

基于此目标，本篇文章作者开发了一种可基因编码的糖链代谢标记技术（GeMGL）。该技术主要利用了“凹凸互补（bump and hole）”的化学策略与MGL方法相结合，选择非天然糖1,3-Pr₂GlcNAl（Bump）及其匹配的焦磷酸酶突变体AGX2^F383G（Hole）的正交组合，在活体动物上实现了细胞特异性糖链标记与分析。

首先，作者从GlcNAz代谢出发，确认了其代谢通路中的焦磷酸酶AGX1/2是限速酶，将其过表达可以增强代谢强度，这也与以前研究一致。作者设想是否可以通过对非天然糖基团以及AGX1/2酶的突变改造实现凹凸互补对。于是，作者设计了炔基修饰的乙酰胺基葡萄糖GlcNAl、脂溶性的1,3-Pr₂GlcNAl和焦磷酸酶突变体AGX2^F383G，通过体外和细胞实验证明了GlcNAl和1,3-Pr₂GlcNAl的代谢完全依赖于AGX2^F383G，其中1,3-Pr₂GlcNAl标记效率更高。

图一：基于非天然糖底物与突变酶凹凸对的细胞特异性糖链标记。

接下来，作者将MCF7-AGX2^F383G-T2A-GFP 和HeLa 细胞进行共同培养，再进行代谢标记，最后通过共聚焦荧光显微镜观察。发现只有表达AGX2^F383G的细胞才能被GlcNAl或者1,3-Pr₂GlcNAl标记上。另外，作者在裸鼠腹腔一侧中注入MCF7-AGX2^F383G-T2A-GFP细胞，另一侧注入MCF7-T2A-GFP细胞作为对照组，成瘤之后，通过瘤内注射标记发现1,3-Pr₂GlcNAl可以在体内环境进行糖链代谢标记，但这种标记严格依赖于AGX2^F383G的表达。作者从多细胞共培养体系和小鼠移植瘤模型出发，证明了GeMGL策略的可行性。

图二：多细胞共培养体系的细胞特异性糖链代谢标记。

图三：小鼠移植瘤模型的细胞特异性糖链代谢标记。

然后，作者将该策略拓展到了转基因小鼠模型中，首先利用心肌细胞特异性的启动子α-MHC实现了AGX2^F383G在小鼠心肌细胞中的特异性表达，然后腹腔注射1,3-Pr₂GlcNAl进行代谢标记。最后结果表明，基于1,3-Pr₂GlcNAl-AGX2^F383G凹凸对的GeMGL策略能够实现小鼠心肌细胞特异性标记以及严格的心肌细胞选择性。

图四：转基因小鼠中细胞特异性糖链代谢标记。

最后，作者结合定量蛋白质组学，利用GeMGL的富集方法进行质谱鉴定，最终在小鼠心肌细胞中鉴定到了582个O-GlcNAc糖蛋白，GO分析表明这些糖蛋白大多分布在糖酵解，TCA循环以及氧化磷酸化途径中，表明O-GlcNAc糖基化可能在心肌细胞的能量代谢过程中发挥作用。

综上，本文报道了一种可基因编码的代谢标记策略，利用“Bump and Hole”与传统的非天然糖代谢标记策略相结合的方式，实现了小鼠体内心肌细胞特异性标记。本文的亮点是不仅在活体动物体内实现了精准的细胞特异性标记，而且还实现了活体内细胞选择性的糖链谱分析。该策略是研究各种疾病动物模型中糖链结构变化以及糖基化生物学作用的一种新的有效的工具。

参考文献

1. Xie, R., Hong, S., Feng, L., Rong, J. & Chen, X. Cell-selective metabolic glycan labeling based on ligand targeted liposomes. J. Am. Chem. Soc. 134,9914–9917 (2012).

2. Xie, R. et al. Targeted imaging and proteomic analysis of tumor‐associated glycans in living animals. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 14082–14086 (2014).

3. Sun, Y. et al. Mechanistic investigation and multiplexing of liposome-assisted metabolic glycan labeling. J. Am. Chem. Soc. 140, 3592–3602 (2018).

4. Chang, P. V., Dube, D. H., Sletten, E. M. & Bertozzi, C. R. A strategy for the selective imaging of glycans using caged metabolic precursors. J. Am. Chem. Soc. 132, 9516–9518 (2010).

5. Shim, M. K. et al. Cathepsin B‐specific metabolic precursor for in vivo tumor‐specific fluorescence imaging. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 14698–14703 (2016).

6. Wang, H. et al. Selective in vivo metabolic cell-labeling-mediated cancer targeting. Nat. Chem. Biol. 13, 415–424 (2017).