介绍一篇2020年4月发表于Nature Chemical Biology的文章，题目为“Antibody-free enzyme-assisted chemical approach for detection of N6-methyladenosin”，文章介绍了一种名为m6A-SEAL的m6A高通量测序方法，利用FTO酶辅助实现了RNA修饰m6A的化学标记，要比基于抗体的方法具有更高的可靠性和灵敏度。文章的通讯作者是北京大学化学与分子工程学院的贾桂芳教授，研究兴趣为核酸化学修饰和RNA表观遗传学在动植物中的调控功能。
【背景介绍】
由于m6A上甲基化学惰性的性质，目前转录组的m6A检测方法主要依赖于抗体免疫沉淀技术（m6A-IP）。m6A-seq（或MeRIP-seq）是最早开发，也是目前使用最广泛的m6A检测方法。它结合了m6A-IP和高通量测序来定位约200个核苷酸长度RNA片段中的m6A位点。受此启发，研究者们进一步开发了miCLIP（或m6A-CLIP）和PA-m6A-seq方法，比m6A-seq具有更高的分辨率。最近出现了两种无抗体的m6A-seq方法。m6A-REF-seq（或MAZTER-seq）是根据RNA核酸内切酶能否切割带有ACA序列的RNA来检测该RNA是否有m6A修饰，但该方法只能识别16%-25%的m6A位点；DART-seq则是利用细胞内表达YTH结构域-胞嘧啶脱氨酶APOBEC1融合蛋白来检测m6A位点，但该方法性能取决于细胞转染效率，且在体外应用受到限制。因此，急需一种无需抗体的全转录组m6A测序方法。
【设计思路】
贾桂芳课题组利用去甲基酶FTO作为催化剂，将mRNA上化学惰性的m6A转化为高反应活性的中间态产物N6-羟甲基腺嘌呤（hm6A）。再利用二硫苏糖醇（DTT）介导的巯基加成反应，将不稳定的hm6A中间体转化为更稳定的N6-二硫代糖醇甲基腺苷（dm6A）；实现了对m6A的选择性化学标记。通过后续的沉淀富集可实现无需抗体的全转录组m6A测序（图1）。此方法被命名为m6A-SEAL，比基于抗体的方法或DART-seq具有更高的可靠性和灵敏度。
图1 m6A-SEAL原理图
【数据分析】
作者首先在模型RNA中验证m6A-SEAL-seq的可行性。经过FTO酶处理和DTT偶联，原来的m6A位点成功转化成dm6A（图2a）。接着，作者从HEK293T细胞中提取poly(A)+RNA，FTO酶处理5分钟后LC–MS结果显示超过50%的m6A变成了hm6A（图2b）。进一步的DTT偶联能将hm6A转化成dm6A（图2b）。之后，DTT修饰的poly(A)+RNA能与MTSEA-biotin反应，进而被SA修饰的磁珠富集（图2c）。作者还考察了m6A-SEAL的灵敏性和专一性。相比于MeRIP，m6A-SEAL能够更高效地富集m6A片段，甚至能富集只含有一个m6A位点的片段（图2d）。
图2 m6A-SEAL-seq的可行性分析
对于HEK293T细胞poly(A)+RNA的m6A-SEAL-seq，两个平行样本中都检测到TPT1和BSG的转录本的m6A位点，与文献报导的位点相一致（图3a）。通过m6A-SEAL-seq鉴定的m6A位点显示出对m6A motif RRACH（R =嘌呤，H = A / C / U）的强烈富集（图3b）。与阴性对照峰相比，m6A峰的中心在共有序列处高度富集（图3c）。转录组中m6A的分布表明，在终止密码子附近有很强的富集（图3d），这与MeRIP-seq测得的m6A分布结果相一致。将m6A位点比对到外显子，发现约有88％的m6A修饰的外显子长于400 nt（图3e），与先前的发现相符。大多数m6A位点（72.5％）存在于编码转录本上，并且优先出现在编码序列和3'非翻译区（3'UTR）内（图3f）。考虑到m6A具有调节从可转座元件转录的重复RNA的功能，作者进一步发现45％的这些基因间m6A位点代表297个重复RNA（图3g）。这些结果表明m6A-SEAL方法能很好地识别人类转录组中的m6A位点。
图3 m6A-SEAL方法识别转录组中的m6A位点
为了进一步评估m6A-SEAL的可靠性和性能，作者首先将其与MeRIP-seq进行了比较。来自m6A-SEAL-seq的HEK293T样本和水稻样本分别测得约77％和约56％的m6A峰与MeRIP-seq的峰重叠（图4a）。作者将m6A-SEAL和MeRIP中的所有m6A位点分为三类：共有位点、m6A-SEAL特有位点和MeRIP特有位点。在HEK293T样本中，所有三个组都能富集典型的m6A motif，但是在水稻样本中，MeRIP特有位点这一组无法识别任何显著的motif（图4b）。宏基因组分析表明，HEK293T和水稻中的m6A-SEAL特有位点具有与共有位点相同的m6A分布特征，而MeRIP特有位点、miCLIP-CITS特有位点、miCLIP-CIMS特有位点和DART-seq特有位点都表现出不同的m6A分布特征（图4c）。作者从m6A-SEAL结果中选择了八个位点（五个m6A位点和三个未甲基化位点），使用他们之前开发的SELECT方法进行验证（图4d）。SELECT是一种基于qPCR扩增方法，以单核苷分辨率检测mRNA/lncRNA中m6A的位置和比例。SELECT验证了这五个m6A位点和三个未甲基化位点，与m6A-SEAL结果一致（图4e）。m6A-SEAL相比于基于抗体的方法在检测m6A位点方面具有更高的可靠性和灵敏度。
图4 m6A-SEAL与其他m6A测序方法的对比
【总结】
总之，该项研究首次利用FTO酶辅助实现了RNA修饰m6A化学标记和高通量测序。m6A-SEAL具有高灵敏度和高特异性的特点，可以应用于少量mRNA样品。文中提到该方法目前的局限性是还不具有单碱基分辨率，还有进一步优化的空间，未来他们将继续对m6A-SEAL进行优化和改造。同时由于该方法还可以标记荧光素，因此有应用于m6A成像方面的潜力。
撰稿：蔡林峰（博士生）
校稿：林世超
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41589-020-0525-x
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