Angew. Chem. :基于可逆的化学酶促标记-亲水富集的O-GlcNAc糖肽分析

  • A+

O-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)修饰发生在丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)残基上,是一种重要的蛋白质翻译后修饰(PTM),参与细胞代谢、信号转导、免疫应答等生理过程。然而,O-GlcNAc修饰丰度低,且处于高度动态变化中,极大地增加了其富集与分析的难度。现有的非共价作用富集法的亲和力和特异性通常较低,难以提高O-GlcNAc鉴定的覆盖度;以化学酶促标记法为代表的共价作用富集策略,显著提高了糖肽富集的特异性,然而引入大质量标签会降低糖肽的鉴定效率,因此,发展O-GlcNAc糖肽的‘无损’成为其高特异性富集、高覆盖度鉴定的关键。

1

图1. 传统化学酶促标记法对比本文基于可逆化学酶促标记的O-GlcNAc糖肽亲水富集法

近期,中科院大连化学物理研究所叶明亮研究员、秦洪强研究员团队与中科院上海药物研究所黄蔚研究员团队合作,报道了一种高效、通用的O-GlcNAc糖肽富集鉴定新方法,其主要包括三部分:1)利用糖苷内切酶的突变体Endo-M N175Q将O-GlcNAc基团上转移寡糖基团,提高糖肽亲水性;2)基于延长糖链的亲水性,采用亲水作用色谱进行标记O-GlcNAc糖肽的富集;3)将富集后的O-GlcNAc糖肽经野生糖苷内切酶Endo-M/S处理,实现了连接糖链的去除,进而避免了糖链对O-GlcNAc糖肽鉴定效率的影响,实现了O-GlcNAc糖肽的无痕富集与检测。

2

图2. 将本文基于可逆化学酶促标记的亲水作用色谱法用于富集O-GlcNAc标准糖肽

作者分别对该方法中的突变体酶和寡糖供体的浓度以及反应时间进行了考察,并将得到的最优条件应用于O-GlcNAc修饰的标准肽段,结果表明该方法中化学酶促标记反应和寡糖基切除反应均比较彻底(两步产率分别在95%和99%以上),且亲水作用色谱与可逆化学酶促标记测量具有良好的兼容性,并且该方法具有优异的富集特异性。

3

图3. 本文方法用于富集生物样品中O-GlcNAc糖肽的技术路线示意

作者将该方法用于HeLa细胞核蛋白质O-GlcNAc糖基化分析,从1.1 mg蛋白样品中共鉴定到1414处潜在O-GlcNAc修饰位点,其中777处(约55%)在人源O-GlcNAc糖基化数据库中收录(1985-2020年),极大程度补充了O-GlcNAc糖蛋白数据库的覆盖度。工作中鉴定到的O-GlcNAc糖蛋白中包括识别RNA上N6-甲基腺苷(m6A)的YTHDF1和YTHDF3蛋白,以及与之形成相互作用网络的另外13种蛋白,而后者与剧烈条件下应激小体的形成密切相关。本工作为应激小体形成与蛋白质O-GlcNAc之间的作用机制研究提供了新线索。

4
5

图4. 本文鉴定到的部分O-GlcNAc糖蛋白的相互作用网络和O-GlcNAc糖肽的MS2谱图

该工作是首例基于寡糖基的整体转移以富集O-GlcNAc肽段的报道,为分析生物样品蛋白质的O-GlcNAc修饰状况提供了一种简便有效的手段。文章的第一作者是中科院大连化学物理研究所的在读博士研究生陈尧和中科院上海药物研究所的唐峰博士。

文信息

Endo-M Mediated Chemoenzymatic Approach Enables Reversible Glycopeptide Labeling for O-GlcNAcylation Analysis

Yao Chen, Feng Tang, Hongqiang Qin, Xuyang Yue, Yongzhan Nie, Wei Huang, Mingliang Ye


Angewandte Chemie International Edition

DOI: 10.1002/anie.202117849


weinxin
我的微信
关注我了解更多内容

发表评论

目前评论: