为大家介绍一篇2020年发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，题目为“Chemical Tagging of Protein Lipoylation”。本文发展了一种蛋白质硫辛酰化修饰的化学选择性标记新方法，并用于细菌和哺乳动物细胞中硫辛酰化蛋白质的蛋白质组学分析。文章通讯作者是来自北京大学化学与分子工程学院的陈兴教授。他们课题组的研究兴趣集中于化学糖生物学，开发化学工具用以研究糖基化的生物学功能及其在相关人类疾病中的作用。（课题组网页：https://www.chem.pku.edu.cn/xchengrp/）
【背景介绍】
蛋白质硫辛酰化（protein lipoylation）是一种保守的翻译后修饰（PTM），发生在从细菌到哺乳动物的各种生物体中。硫辛酰胺（lipoamide）是调节酶活性和维持蛋白复合体结构完整性的必要的辅助因子之一。蛋白质硫辛酰化的失调与多种疾病有关，如硫辛酰基转移酶1缺陷症，高甘氨酸血症，乳酸酸中毒和癫痫等。然而，对蛋白质硫辛酰化修饰的标记和大规模的蛋白质组学分析仍然具有挑战性。目前，硫辛酸（lipoic acid, LA）抗体常被用于富集或检测硫辛酰化的蛋白质。但是，该方法无法区分硫辛酰化蛋白及与其相互作用的蛋白。化学选择性连接（chemoselective ligation）能将小分子探针与蛋白质PTM部分进行共价连接，具有超高的亲和力。化学选择性连接为蛋白质PTM的蛋白质组学分析提供了机会，并与凝胶电泳和细胞成像检测PTM等手段互为补充。
【设计思路】
本文提出了一种碘乙酰胺（IAA）辅助的硫辛酸-环辛炔连接的方法（iLCL），可在硫辛酰胺上选择性地共价偶联荧光基团或亲和标签。如图1所示，为了实现特异性的化学连接，iLCL利用N-乙马来酰亚胺来封闭半胱氨酸上的巯基，并利用IAA特异性地与1,2-二硫戊环中的二硫键反应产生次磺酸，而不与非环状的二硫键反应。随后，携带富集或检测探针的环辛炔可与次磺酸进行共价偶联。
图1 基于iLCL的蛋白质硫辛酰化修饰的化学选择性标记示意图
【数据介绍】
为了实现小分子探针和硫辛酰胺中环状二硫键的特异性化学连接，而不与蛋白质中其他线性的二硫键发生反应，作者考虑了不同类型二硫键的化学反应活性。如图2A所示，线性二硫键通常具有扭曲构象，CSSC的二面角约为90度，以减小完全占据的硫3pπ杂化轨道之间的重叠。而环状二硫键由于构象限制，CSSC的二面角小于35度，导致HOMO轨道能量升高。因此，环状二硫键是比线性二硫键更好的亲核试剂。作者将LA作为一个模型系统，考察了将IAA作为亲电试剂的可行性。如图2B所示，LA和IAA发生亲核取代反应，产物水解生成不稳定的次磺酸。作者进一步选用氮杂二苯并环辛炔胺（DBCO-NH2）作为次磺酸化学选择性标记试剂。作者直接将LA，IAA和DBCO-NH2混合进行反应。通过HPLC和MS分析证明了成功合成了产物2（图2C），且该反应达到平衡所需的时间为6小时（图2D）。此外，具有线性二硫键的3,3'-二硫二丙酸 (DTA) 不与IAA反应，说明了IAA和环状二硫键的反应具有很好的化学选择性。
图2 利用小分子模型开发iLCL策略
作者接着将iLCL用于标记纯化的硫辛酰胺化蛋白质，并用于优化标记条件。作者首先制备了硫辛酰胺化的血清白蛋白（LA-BSA），然后将它与IAA和DBCO-Cy5反应，最后利用凝胶荧光扫描成像来读取信号。如图3A所示，LA-BSA被明显检测出硫辛酰化，而经过巯基封闭的BSA没有被检测到硫辛酰化的信号。未经过巯基封闭的野生型BSA被检测出微弱的硫辛酰化信号，主要是因为DBCO也能够与半胱氨酸发生反应，这同时说明了巯基封闭的重要性。该标记反应可以被LA竞争（图3B），而不是DTA（图3C），证明了iLCL检测蛋白质硫辛酰化修饰的特异性。能够与次磺酸反应的5,5-二甲基-1,3环己二酮（DCD）能够抑制该标记反应，并且抑制作用随着DCD的浓度增加而加强（图3D）,说明该标记反应产生了次磺酸中间体。如图3E所示，该标记反应随着IAA浓度的增加而加强。
图3 用iLCL标记纯化的硫辛酰胺化蛋白质
作者接着研究了iLCL的生物学应用。他们把iLCL应用于检测E. coli细胞裂解液中三种已知的硫辛酰化的蛋白质（ODP2, ODO2, GCSH）。如图4A所示，凝胶荧光扫描成像分析表明成功地检测到蛋白质的硫辛酰化修饰，并且加入LA可以增强信号强度，而硫辛酰化位点发生突变的ODO2K44Q没有信号（图4A）。作者还将iLCL用于分析蛋白质的硫辛酰化位点。具体做法是：首先用包含肼刺激响应的可裂解linker的DBCO-biotin标记纯化的ODP2，并用SA-beads富集ODP2。然后在beads上降解并去除未经过硫辛酰化修饰的多肽。随后用肼释放硫辛酰化的多肽，并用LC-MS/MS成功鉴定出全部的3种硫辛酰化位点（图4B）。作者接着将iLCL用于标记E. coli和RAW264.7巨噬细胞的蛋白质，链霉亲和素印迹图像出现多个条带，表明细胞中有多种蛋白质发生硫辛酰化修饰（图4C和4D）。为了说明iLCL可以用于细胞成像分析，作者对SH-SY5Y细胞进行固定，透膜和封闭巯基处理，然后将它们与IAA和DBCO-Cy5反应，结果发现Cy5信号和线粒体信号定位在一起，与预期相符（图4E）。
图4 iLCL策略的生物化学应用
作者最后将iLCL应用于细菌和哺乳动物细胞中硫辛酰化蛋白质的蛋白质组学分析。作者首先利用DBCO-biotin标记E. coli和RAW264.7巨噬细胞裂解溶液中的硫辛酰化蛋白质，然后用SA-beads捕获被标记的蛋白质，随后用胰酶降解被beads捕获的蛋白质，最后用稳定同位素二甲基标记策略进行定量蛋白质组学分析（图5A）。作者在E. coli和RAW264.7巨噬细胞裂解溶液中分别鉴定出6种和9种硫辛酰化修饰的蛋白质，其中包含3种E. coli和5种RAW264.7巨噬细胞中已知的硫辛酰化蛋白质（图5B-5C）。如图5D所示，蛋白免疫印迹实验表明iLCL标记实验显著地富集了GFPT1，说明它可能是一种新型的硫辛酰化蛋白质。上述结果说明iLCL为多种生物系统中硫辛酰化蛋白质的蛋白质组学分析提供了一种有效方法。
图5 基于iLCL策略的蛋白质硫辛酰化修饰的蛋白质组学分析
【文章总结】
作者发展了一种碘乙酰胺辅助的硫辛酸-环辛炔连接的方法（iLCL），用于化学选择性地标记硫辛酰化的蛋白质。该方法首次展示了大规模分析硫辛酰化的蛋白质（蛋白质组学分析）的可行性，且具有超高的标记灵敏度和特异性。
撰稿人：刘艺龙（博士生）
校稿：林世超
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202010981
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