为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章“Chemoenzymatic Labeling of Extracellular Vesicles forVisualizing Their Cellular Internalization in Real Time”。本文的通讯作者是南开大学的刘定斌教授，该课题组主要开发疾病快速诊断方法、超痕量生物标志物的高灵敏度多重分析方法和体内诊断的高信噪比等离子体生物成像系统。

      细胞外囊泡(EVs)是一种大小从50纳米到1000纳米不等的膜状纳米颗粒，包含来母代细胞的复杂分子，包括蛋白质、核酸、脂质和碳水化合物等。因此，它们在调节受体细胞的多种病理生理功能如肿瘤转移、炎症、组织再生等方面发挥重要作用。由于其体积小、生物组成复杂，很难对其进行标记。现有的EVs标记策略主要基于蛋白或脂质修饰。基于蛋白质的标记方法依赖于细胞内过表达的荧光蛋白的基因工程或膜蛋白与荧光染料的化学结合，通常繁琐并有可能损害EVs的生物活性。基于脂质的标记方法最常利用EVs的疏水层与特定染料相结合。这些染料以非共价的方式组装成EV膜，在生理环境中不稳定，导致染料从EV膜中浸出。此外，这些染料可能在水溶液中形成聚集体或胶束结构，这在EV吸收实验中可能给出误导信息。如果染料能够共价连接在EV磷脂膜结构上，这些问题都将可以得到解决。然而，磷脂的反应活性较低，难以进行化学改性。到目前为止，共价磷脂标记策略多指代谢标记，繁琐、耗时的细胞培养和多步骤的实验操作限制了其发展。因此，开发一种简单的共价磷脂修饰EV标记策略是非常必要的。

      在这项研究中，作者报告了一种化学酶辅助的共价修饰策略，该策略通过简单的两步过程直接标记EV磷脂酰胆碱，从而实现对EV的标记。在磷脂酶D (PLD)酶的催化下，EV膜中磷脂的headgroup(胆碱)与炔醇交换，然后与叠氮荧光团进行点击化学反应，使EV具有荧光标记。他们的灵感来自于PLD酶能够在生理条件下水解磷脂酰胆碱成磷脂酸和胆碱。而在初级醇存在的情况下，PLD酶还可以催化磷脂酰胆碱的转磷酸酯化反应，产生非自然的磷脂酰醇。因此可以利用该反应，使得醇与胆碱发生交换。

       首先，他们向我们证明了该标记需要PLD酶、炔醇、Cy5-N3同时存在下才能够成功标记EVs，具有较低的背景。接下来，为了验证该标记方法的生物相容性，他们又对标记前后EVs的形态和生物学功能进行了比较。TEM图像显示，EVs保留了具有代表性的碟状形态，即在改性过程中未破坏或改变囊泡的完整性。细胞迁移实验证明，化学酶标记策略对EVs的生物活性影响很小。
EVs作为细胞间的沟通者参与了许多生理过程。然而，EVs对受体细胞的内化过程和摄取机制尚未明确揭示。因此，在本研究中，他们利用化学酶法标记来跟踪、探索EVs被RAW264.7细胞摄取的动态过程和机制。他们发现EVs与丝状伪足的结合诱导了向细胞体的快速横向运动。大多数EVs最初附着在活细胞的丝状伪足上，然后沿着丝状伪足与质膜相互作用，随后融合。由于该标记是一种共价标记策略，因此作者随后还证明了该方法能够用来进行EVs内化作用的长期跟踪（以小时计）。

      总的来说，作者首次构建了利用荧光染料原位反应显示EVs天然磷脂酰胆碱的化学酶标策略，开发了一种简单高效、信噪比高、生物兼容性好的EVs共价标记方法。

原文作者：WQW
原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acs.analchem.9b04608
原文引用：10.1021/acs.analchem.9b04608