今天分享的文章是2018年发表在JACS上的“Chemical Profiling of the Endoplasmic Reticulum Proteome Using Designer Labeling Reagents”。文章作者是来自京都大学的Itaru Hamachi团队，该实验室长期致力于研究利用有机化学对活细胞蛋白质进行原位分析。

摘要

内质网(Endoplasmic reticulum, ER)是一种重要的亚细胞成分，负责蛋白质的合成、加工和运输。几乎所有质膜相关蛋白和分泌蛋白都在内质网中合成，并通过囊泡运输运送到最终目的地。ER与其他细胞器（例如线粒体、高尔基体和核内体）之间的通讯在多种细胞功能中起着关键作用。此外，有研究表明，细胞应激引起的ER功能障碍与多种疾病有关，包括糖尿病、炎症和神经退行性疾病。因此，对ER相关蛋白的全面表征不仅可作为一项基础生物学研究，而且 有助于了解此类疾病的病因。尽管ER具有重要作用，但由于ER蛋白质的性质不稳定，所以分析ER蛋白组成和动力学的化学工具仍然非常有限。因此，在这篇文章中，作者开发了一个可定位到ER的活性分子（ER-localizable reactive molecules, ERM），作为以ER为中心的化学蛋白质组学的工具。ERM有一个ER高亲和力基团，故可以自发定位在活细胞的ER中；同时还有一个带有荧光标记的标签基团，他可以选择性地标记ER相关蛋白，从而实现标签介导的ER蛋白富集和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)鉴定。使用这种方法，作者对HeLa细胞的ER进行了蛋白质组学分析，并发现了三种新的ER相关蛋白：PAICS、TXNL1和PPIA。同时，ERM探针与该小组先前开发的可定位细胞核和线粒体的标记分子同时使用，同时研究单个生物样本细胞器化学蛋白质组。此外，作者还将该探针应用于研究内质网应激（ER stress），并利用细胞培养基中氨基酸同位素标记SILAC(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture)定量MS技术，对衣霉素诱导的ER应激时ER相关蛋白响应的动态变化进行定量分析。总上，基于ERM的化学蛋白质组学为标记和分析活细胞中的ER相关蛋白提供了强大的工具。

实验设计及结果

文章的ER标记探针基于两部分，ER定位的活性部分和带有荧光的氟化的对甲氨基酚（Rhodol），这一部分可以作为蛋白富集的靶点，作者专门设计了针对Rhodol的抗体以富集探针标记的蛋白，然后利用质谱进行蛋白质组分析；另外作者共设计了6种具有不同活性部分的分子，有氯代烷烃类、磺酰氟类和硫酯类，他们的亲脂性各不相同。（图1）6个分子的荧光强度以及和ER-Tracker荧光的皮尔森相关系数也有所不同，结果显示ERM 3，5，7具有较高的细胞内

图1. ERM 介导的选择性标记ER 相关蛋白分析示意图和6种ER定位

浓度及皮尔森相关性。虽然ERM 5有较强的荧光强度，但其和ER-Tracker的皮尔森相关系数不及ERM 6, 后续的蛋白组学研究也显示ERM 6有更高的特异性。总蛋白凝胶荧光显示三个分子标记的蛋白也有所不同。（图2）

图2. ERM 荧光定位和ER-Tracker共定位，总蛋白凝胶荧光成像

作者利用anti-Rhodol抗体分离和富集Rhodol标记的蛋白分子，经过消化，LC-MS/MS，最后分析这些得到的蛋白。然后通过蛋白数据库、人工识别分配等将这些蛋白质归为未知位置、其他细胞器/细胞基质、膜结构/高尔基体/细胞外、人工识别为ER、数据库归类为ER共5类蛋白。总体来说，通过ERM得到的蛋白92%可以归为分泌型的蛋白。ERM 6得到的蛋白质数量最多，其中人工或数据库归类的ER蛋白约占43%，当然，也有大量的（50%）膜结构/高尔基体/细胞外蛋白被标记。（图3）实验也发现了三个新的定位于ER的蛋白，PAICS、XNL1和PPIA并且也用双免疫荧光验证了它们在ER的分布（原文Figure 5）

图3.基于ERM 的 rhodol 标记的蛋白质的鉴定和分析

最后，作者又运用该ERM标记技术来研究内质网应激。内质网应激的特征是ER中的未折叠蛋白增加，导致相关的细胞反应激活，如未折叠蛋白反应（UPR）和ER相关蛋白降解（ERAD）。实验先利用衣霉素处理细胞4小时诱导ER应激，然后用ERM 6进行标记，结合SILAC技术，将对照组和实验组蛋白同时用Rhodol抗体富集，消化，MS定量分析ER应激后蛋白组的变化。3次生物重复一共富集到87个蛋白，其中84个蛋白都属于分泌蛋白，39个蛋白属于ER蛋白。有6个蛋白在ER应激之后显著升高（超过2倍），像是已报导的UPR中会升高的蛋白GRP78，HSP60和HO2都在此实验中得到验证，WB结果也一致。而另一个ER相关蛋白HSP90AB则显著下降。（图4）这些结果表明ERM标记法可以成功应用到ER蛋白组的动态分析。

图4. ERM用于ER 应激引起的蛋白质组变化的SILAC定量MS分析

总结

综上所述，本文作者开发了一套 ERMs，它们在活细胞的ER中自发积累，并选择性地标记ER蛋白。这样的选择性富集和定量分析，不用对ER进行耗时的技术分离。这种方法既不用基因工程技术，也不需要苛刻的标记条件。重要的是，它具有发现未知 ER 相关蛋白的潜力。他们还证明了同时使用三种细胞器可定位反应分子的可行性，该技术是监测同一细胞培养物中多个细胞器的蛋白质组变化的有力工具。此化学策略还可以扩展到其他亚细胞器，如溶酶体、高尔基体和过氧化物酶体，将有助于进一步阐明活细胞中复杂的细胞器蛋白质网络。

当然作者也提到本文的不足之处，那就是相较于UniProt数据库总结的1190个ER蛋白，此研究所富集分析到的蛋白仍然只占很小的一部分（约17%）。作者认为可能有两方面的原因，一是ERM对ER亚结构可能有不同的倾向性，二是那些未能标记蛋白质表面可能没有合适的亲核氨基酸。作者认为cLogP值与分子ER 定位之间的线性关系可能有助于未来合理设计各种 ER 定位试剂。

(化学分子标记的特异性是一个很关键的问题，不同化学修饰的优化对分子的性能影响很大，同时作为一种标记探针工具，又要尽可能地减少对细胞本身的影响。如何实现从细胞内到生物体内模型的应用也是一个难题。)

作者: TT

校稿: ZL

编辑: Lynn

文章链接：DOI: 10.1021/jacs.8b08606