英文原题：Photoredox-Catalyzed Decarboxylative C‑Terminal Differentiation for Bulk- and Single-Molecule Proteomics

通讯作者：

Eric V. Anslyn 美国得克萨斯大学奥斯汀分校

Edward M. Marcotte 美国得克萨斯大学奥斯汀分校

Steven Bloom 美国堪萨斯大学

供稿人：Ziqi Liu (刘子琦) 北京大学

大家好，本期为大家介绍一篇发表于ACS Chem. Biol的文章“Photoredox-Catalyzed Decarboxylative C‑Terminal Differentiation for Bulk- and Single-Molecule Proteomics”，通讯作者为美国德州大学奥斯汀分校的Eric V. Anslyn、Edward M. Marcotte及堪萨斯大学的Steven Bloom。

图1. 光催化C-端脱羧衍生化用于高通量与单分子蛋白质组学

近年来，蛋白质谱技术以及单分子多肽测序技术的发展大大促进了蛋白质组学研究， 成为了生命科学研究的强大工具。而这些技术的开发，同样依赖于高效的蛋白质化学标记技术的发展。例如，在质谱蛋白质组学中，蛋白/多肽的富集、定量、识别等往往是化学标记技术的用武之地；而在单分子测序中，多肽链亦需要通过的化学标记以实现荧光标记和锚定。尽管目前已有多种多样的蛋白/多肽标记技术得以应用，但其集中于几种特定氨基酸残基（Lys、Cys等）以及N端。相反，C端化学标记技术的发展和应用仍处于起步阶段，具有可观的开发空间与应用潜力。

图2. 光催化C-端脱羧衍生化反应

基于先前由Steven Bloom和David MacMilan等人开发的光催化C端脱羧衍生化反应（图2），作者在本工作中进一步将其与蛋白质谱组学及单分子多肽测序结合起来。该反应以光黄素（lumiflavin）为光催化剂，Michael受体作为反应试剂，蓝光照射下在水相环境中实现蛋白/多肽C-端的脱羧偶联反应，而氨基酸侧链的羧基则不受影响。作者采用亚甲基降冰片酮（3-methylene-2-norbornanone，NB）为Michael受体与模型多肽进行反应，通过二级质谱证实并解析了所形成的C端修饰肽段。

图3. C端标记肽段的色谱与二级质谱分析

随后，作者验证了该反应能够用于bottom-up蛋白质组学质谱样品的C端衍生化。作者采用了三种来源的蛋白质样品，分别为人源K562细胞的蛋白质组、酵母的蛋白质组以及纯的牛血清白蛋白（BSA），通过胰酶或GluC消化成肽段样品，并分别进行光催化C-端标记反应。LC-MS/MS的检测结果表明，不论对于人源、酵母来源还是纯蛋白的样品，以及不论是胰酶还是GluC消化的样品，该光催化反应都能取得良好的标记效率。其中，对于GluC消化的酵母蛋白质组样品的标记率可达到89%。

图4. 光催化C端标记反应用于bottom-up蛋白质组学质谱样品的化学处理

同时，作者还研究了该反应对具有不同C端氨基酸的肽段的偏好性。通过对蛋白质谱中所检测到的标记肽段进行统计分析，作者发现对于大多数种类的C端氨基酸，该反应均能高效地进行标记且差异性较小，仅对少数氨基酸标记效率较低（如His，Trp等），从而说明了该反应的普适性。

图5. 光催化C端标记反应对不同氨基酸的偏好性分析

之后，作者将该反应成功运用于蛋白/多肽的单分子荧光测序技术（fluoro-sequencig）中。该测序技术需对肽链上的特定残基进行荧光标记（如Lys等），再通过Edman降解结合单分子荧光检测能够得到特定残基在该肽链上位置信息，进而通过数据库比对推知肽链的可能序列。其中，单分子荧光检测要求肽链预先通过C端锚定在基质上，以进行单分子成像检测。作者以血管紧张肽（angiotensin）为模型，采用光催化C端脱羧标记反应可得到C端炔基修饰的肽链；该肽链中的Asp等羧酸残基不受影响，可进一步进行荧光标记；接着将肽链通过点击化学锚定至叠氮修饰的基质表面，最后进行单分子荧光测序。实验结果表明，Edman降解中的荧光降低趋势符合预期，证明了单分子荧光测序在该模型中的成功。

图6. 光催化C端标记反应用于蛋白/多肽单分子荧光测序

综上，作者成功展示了光催化C端脱羧衍生化反应在质谱蛋白质组学和多肽单分子荧光测序中的应用，体现了该反应体系在高通量与单分子蛋白质组学领域的应用潜力。该反应具有较高的标记效率、对多数氨基酸的普适性等优点。作者首先展示了该反应能够运用于bottom-up蛋白质组样品的C端标记处理，未来在蛋白质组C端特异性富集、识别等方面能够取得应用；而该反应在多肽单分子荧光测序上的运用，则为该测序技术提供了新的化学选择，展现出广阔的开发与应用前景。

ACS Chem. Biol. 2021, ASAP

Publication Date: November 4, 2021

https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00631

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