多细胞生物是由各种类型的细胞组成，其基因表达和功能取决于其空间位置。单细胞RNA测序（scRNA-seq）已经成为一种测量单个细胞基因表达的强大工具，单次测序的通量通常为数千个细胞。多细胞生物的细胞样品大多是通过机械或酶解组织匀浆获得的。因此，传统的scRNA-seq不可避免地会导致细胞空间位置和细胞-细胞接触信息的丢失。为了解决这一问题并保留scRNA-seq过程中的空间信息，近年来空间转录组学方法的开发受到了广泛关注。例如，HDST和Slide-seq等方法利用条形码阵列在原位捕获转录本，从而能够在组织切片中对空间基因表达进行分析。然而，空间分辨率受到条形码阵列点大小的限制，使得单细胞分辨率难以实现。另一种基于多路原位杂交的空间转录组学技术包括MERFISH和SeqFISH，提供了优秀的空间分辨率，但需要专门的设备，且通量相对较低。一种很有前途的策略是用光敏探针标记细胞，用荧光记录其空间信息，然后将标记的细胞分离，用于常规的scRNA-seq。但这些方法中大多数都需要两步反应，并且以非选择性的方式将光敏探针与细胞结合，会产生较强的背景信号，因此难以实现细胞的准确定位。

本文作者开发了一种光学细胞标记（OpTAG）策略，通过适当的光化学作用，实现高效和高空间分辨率的光学细胞一步标记。带有光保护的醌甲基化物（quinonemethide, QM）是一种小分子化学交联剂，可以通过远紫外光诱导，从而特异性的释放活化的醌甲基化物进行蛋白-蛋白以及蛋白-核酸之间的交联。这种策略不仅能够使得蛋白交联获得时间分辨率，引入的强活性醌甲基化物可与许多的亲和性残基，如His、Lys、Tyr等侧链反应而产生蛋白交联。作者设想，在活细胞中光化学原位生成QM可以实现OpTAG，然后通过流式进行细胞分选，之后对目标细胞进行scRNA-seq（OpTAG-seq）（图1）。

图1. OpTAG-seq工作流程示意图

为了光学生成QM，酚前体的酚羟基可以被光裂解基团（如邻硝基苯基）保护。作者设计并化学合成了AzONPF，一种叠氮化功能化的光活化QM。其机理是在365nm或405nm紫外光照射后，邻硝基苯的光保护基团被释放，然后氟离子自发消除，生成对QM中间体（图2a）。正如预期的那样（图2b），AzONPF 在水溶液中被 365 nm 紫外光照射，生成的 QM 中间体被水完全淬灭，形成羟基取代产物（产物 1 ）和亚硝基苯甲醛（产物 2）。在细胞环境中，QM会与亲核试剂，包括蛋白质的亲核残基发生反应。为了评价用AzONPF标记紫外依赖性蛋白的能力，将AzONPF与HeLa细胞孵育，然后用365 nm紫外光照射，所得细胞裂解液与氮杂二苯并环辛烷偶联的Cy5反应（DBCO-Cy5），并通过凝胶成像进行分析（图2c）。结果显示，实验组AzONPF中观察到较强的Cy5信号，而在阴性对照组AzONPOH（一种AzONPF类似物，其中氟被一个羟基取代，因此QM不能产生）则没有。这些结果表明，AzONPF可用于细胞裂解液和活细胞中细胞蛋白的光控化学标记。

图2. AzONPF作为OpTAG探针的评价

在AzONPF的基础上，作者建立了利用荧光探针进行活细胞光学标记的OpTAG。将AzONPF与DBCO-biotin通过SPAAC偶联生成ONPF-biotin（图3a）。接下来，作者验证了ONPF-biotin在活细胞上进行标记的效果。将HeLa细胞与ONPF-biotin孵育，用405 nm激光照射选定的区域，然后用链霉亲和素Alexa Fluor 647染色，激光共聚焦结果显示，只有在激光照射区域内的细胞被荧光标记（图3b）。用胰蛋白酶裂解细胞后，流式细胞术分析显示，OpTAG标记的细胞同样容易通过荧光信号与未标记的细胞区分开来（图3c）。为了证明OpTAG的多重标记能力，作者利用三个不同颜色的链霉亲和素-荧光团偶联物，即SA-AF488、SA-AF 555和SA-AF 647进行三轮标记。在每一轮中，四个选定的区域被辐射并用一种颜色标记。其中一个区域用三种颜色标记，三个区域用两种颜色标记，三个区域用一种颜色标记，总共有七个细胞区域用七种不同的颜色标记（图3d）。由于QM具有极高的反应活性，作者想知道OpTAG标记是否能够在亚细胞尺度上具有空间分辨率。在单个HeLa细胞上，作者先用激光照射左半部分细胞，并用SA-AF 488标记，然后用激光照射右半部分细胞，并用SA-AF 647标记。共聚焦荧光显微镜显示，两个标签精确地定位在辐射区域，显示该方法具有亚细胞分辨率。综上所述，这些结果表明OpTAG可以在单细胞分辨率下用多种颜色标记活细胞。

图3. OpTAG用于多色细胞标记

随着OpTAG策略的建立，作者将OpTAG与荧光辅助细胞分选（fluorescence-assisted cell sorting, FACS）和scRNA-seq相结合来建立OpTAG-seq。为了验证OpTAG-seq，作者构建了一个模型系统，将HeLa和SH-SY5Y细胞进行共培养（图4a），并使用OpTAG对位于右侧的HeLa细胞标记PE，对位于左侧的SH-SY5Y细胞标记AF647（图3b）。之后将共培养的细胞分离，用FACS分别利用PE和AF647通道对两个细胞群进行分选。总共48个PE标记的细胞和48个AF647标记的细胞被分离，并利用Smart-seq2进行scRNA-seq。UMAP分析结果显示，PE标记和AF647标记的细胞明显聚在两个不同的群体中，与OpTAG标记的位置和细胞类型相匹配（图3c）。

图4. OpTAG-seq支持空间解析的scRNA-seq

最后，作者将OpTAG-seq应用于研究癌细胞迁移过程中空间定义的转录程序。癌细胞通过多种分子机制在组织内转移和器官间转移。特别是，癌细胞通过局部富集的细胞表面整合素受体与细胞外基质形成“接触点”。无论是在癌细胞稳定的粘附还是在细胞迁移过程中缓慢的沿基质滑动，接触点都发挥着重要的调节作用。为了分析空间编程基因在癌细胞迁移中的表达，作者使用培养插入物在一个限制区域传代HeLa细胞。取出插入物培养3 d后，用共聚焦显微镜观察细胞。与内侧细胞相比，位于边缘的外侧细胞表现出更大的伸展形态，表明它们是迁移的（图5a）。利用OpTAG分别对300μm的外层细胞用AF647标记，300 μm的内部细胞用PE标记。胰蛋白酶解离后，用FACS分离细胞，并利用Smart-seq2 进行scRNA-seq。UMAP分析结果显示，内、外层的细胞可以明显的分群（图5b）。在迁移的癌细胞中，OpTAG-seq识别出一组基因，与内部细胞相比，该组基因在外部细胞中上调或下调（图5c，d）。GO分析显示，上调的基因在细胞迁移、对伤害的反应和细胞运动性等途径中高度富集（图5e），并在包括局灶性粘连的细胞成分中富集。这些结果与迁移细胞形成许多接触点的事实相一致。例如，TAGLN和KRT17是两个被证实在外侧细胞中显著上调的基因，TAGLN和KRT17均可促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。相反，在外侧细胞中被抑制的基因可能是细胞迁移的负调控因子。例如， PDK4和MUC16在外侧细胞中减少。而沉默PKD4和MUC16可以促进各种癌细胞的增殖和迁移。为了证实由OpTAG鉴定的差异调控基因可能代表蛋白的表达，作者选择KRT17和MUC16作为代表进行验证。利用KRT17和MUC16特异性抗体进行免疫荧光染色，发现外侧细胞中KRT17蛋白表达较高，内侧细胞中MUC16表达较高（图5f）。

图5. OpTAG-seq在癌细胞迁移中的应用

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202113929